免疫細(xì)胞及其功能檢驗技術(shù)（免疫學(xué)檢驗課件）

第二十二章免疫細(xì)胞及其功能檢驗技術(shù)免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、各種粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和肥大細(xì)胞等。臨床上如出現(xiàn)感染、自身免疫病、免疫缺陷癥、腫瘤等疾病以及移植后的免疫抑制狀態(tài)時，均可出現(xiàn)不同免疫細(xì)胞或其亞群的數(shù)量和功能的變化。※檢測：各類免疫細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和功能測定※方法：體外法為主※目的：判斷機體免疫狀態(tài)※意義：探討疾病的發(fā)病機制、發(fā)展、預(yù)后、療效

根據(jù)各類免疫細(xì)胞獨特的表面標(biāo)志及其特殊功能，運用一定方法將其從血液或組織中分離出來，對其進(jìn)行數(shù)量和功能測定，是觀察機體免疫狀態(tài)的一種重要手段,也是細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)中進(jìn)行細(xì)胞分離、培養(yǎng)和建立細(xì)胞株等研究的重要基本技術(shù)之一。目錄免疫細(xì)胞的分離與純化1淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能檢測2吞噬細(xì)胞功能檢測3第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離與純化免疫細(xì)胞的分離方法很多，主要根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志、理化性狀和細(xì)胞功能等特征。應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康?、所分離的目的細(xì)胞群種類、數(shù)量和純度等要求選擇分離方法。所用的方法應(yīng)力求操作簡便、盡量保持細(xì)胞活性兼顧細(xì)胞純度和獲得率。1外周血單個核細(xì)胞的分離2淋巴細(xì)胞的純化及其亞群的分離3白細(xì)胞的分離吞噬細(xì)胞的分離4（一）自然沉降法是利用血細(xì)胞自然沉降率的分離方法。采集外周靜脈血，肝素抗凝，將含抗凝血的試管直立靜置室溫30～60min后，由于紅細(xì)胞沉降速率較快，可使白細(xì)胞與之分離。上層為淡黃色血漿，底層為紅細(xì)胞，緊貼紅細(xì)胞層上面的灰白層為白細(xì)胞。吸取富含白細(xì)胞的細(xì)胞群，離心洗滌后加入少量蒸餾水或含氯化銨的Gey溶液，經(jīng)短時間的低滲處理，使紅細(xì)胞裂解，經(jīng)過反復(fù)洗滌可得純度較高的白細(xì)胞懸液。一、白細(xì)胞的分離（一）自然沉降法加抗凝血于試管中室溫或37℃中靜置（30-60min）分層結(jié)果示意圖某些高分子聚合物如明膠、右旋糖酐、甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等可使紅細(xì)胞凝集成串，加速紅細(xì)胞沉降，使之更易與白細(xì)胞分離。

RBC血漿(抗凝血)WBCRBC此法白細(xì)胞獲得率比自然沉降法高，但其中的明膠法可使白細(xì)胞粘性增加，對實驗產(chǎn)生一定影響。（二）高分子聚合物沉降法（二）高分子聚合物沉降法抗凝血與等量3%明膠或6%右旋糖酐溶液混勻室溫或37℃中靜置（30～60min）分層結(jié)果與自然沉降法類似優(yōu)點：速度快、得率高不足：白細(xì)胞黏性增加

外周血單個核細(xì)胞(PBMC)主要指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，是免疫學(xué)實驗中最常用的細(xì)胞群，也是進(jìn)行T細(xì)胞和B細(xì)胞分離純化的重要環(huán)節(jié)。各種血細(xì)胞比重不同,利用密度梯度離心進(jìn)行分離常用分層液：ficoll－h(huán)ypaque（聚蔗糖-泛影葡胺），percoll二、外周血單個核細(xì)胞的分離人外周血中各類血細(xì)胞密度常用的分離液：Ficoll液和Percoll液尤以密度為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分層液（Ficoll液）最常用。細(xì)胞比重血小板1.030~1.035PBMC1.075~1.090多核白細(xì)胞1.092紅細(xì)胞1.093用1.077±0.001的分層液可將細(xì)胞分離Ficoll分離液法：密度1.077±0.001，主要用于分離外周血中的單個核細(xì)胞。

原理：Ficoll分層液：2份6%聚蔗糖（ficoll)水溶液+1份34%泛影葡胺（hypaque)生理鹽水溶液。離心：密度梯度離心分離：各類細(xì)胞按其相應(yīng)密度重新分布。分離純度可達(dá)95%，細(xì)胞獲取率80%。試驗盡量在低溫下進(jìn)行（4℃~8℃或冰?。?/p>

（一）Ficoll分離法注意：溫度以20℃最適宜，超過25℃影響細(xì)胞得率Ficoll分層液分離單個核細(xì)胞示意圖（二）

Percoll分層液法連續(xù)密度梯度分離液（Percoll液+PBS，離心）加入PBMC懸液或抗凝全血1000×g離心20min結(jié)果示意圖78％98％（二）Percoll分離單個核細(xì)胞三、淋巴細(xì)胞的純化及亞群的分離采用Ficoll和Percoll分離法獲得的細(xì)胞懸液成分仍然較為復(fù)雜、均一性不佳。通常需要進(jìn)一步分離純化淋巴細(xì)胞及其亞群。分離原理主要基于細(xì)胞的表面標(biāo)志和功能等性質(zhì)。淋巴細(xì)胞及其亞類的分離純化是免疫學(xué)檢驗與研究的重要基礎(chǔ)技術(shù)。﹡紅細(xì)胞的去除：一般采用無菌蒸餾水低滲裂解法或0.83%氯化銨處理法。﹡血小板的去除：將PBMC懸液通過離心洗滌2～3次，?？扇コ齈BMC中絕大部分混雜的血小板。在某些疾病狀態(tài)下，若外周血中血小板數(shù)量異常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度離心法去除PBMC中混雜的血小板。一、淋巴細(xì)胞的純化

PBMC懸液主要含淋巴細(xì)胞，但一般還混雜有數(shù)量不等的單核細(xì)胞及少量粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板。﹡單核細(xì)胞的去除：黏附法羰基鐵吞噬法（磁鐵吸引法）苯丙氨酸甲酯去除法

1．粘附法（貼壁法）單核細(xì)胞和粒細(xì)胞具有粘附玻璃、塑料和葡聚糖凝膠的特性，通過PBMC與玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的非粘附細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞。將已制備的單個核細(xì)胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細(xì)胞幾乎為純淋巴細(xì)胞，繼用橡皮刮下貼壁的細(xì)胞即為純單核細(xì)胞群。因B細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法分離的淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞有所損失。亦可應(yīng)用玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG-10柱，清除粘附的細(xì)胞，洗脫液中主要是淋巴細(xì)胞。此法簡便易行，對細(xì)胞損傷極少，缺點是B細(xì)胞也有較弱的粘附能力，因此有部分B細(xì)胞丟失。該法去除單核細(xì)胞后，大約95%的單個核細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，活性大于95%。2．羰基鐵粉吞噬法單核細(xì)胞具有吞噬羰基鐵粉的能力，吞噬羰基鐵粉后的單核細(xì)胞密度增大，再經(jīng)聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心后，則單核細(xì)胞沉積于管底而被去除。也可在單核細(xì)胞懸液內(nèi)加入羰基鐵粉顆粒，待單核細(xì)胞充分吞噬羰基鐵粉后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中即含較純的淋巴細(xì)胞。3．苯丙氨酸甲酯去除法苯丙氨酸甲酯(PME)具有親溶酶體性質(zhì)，能滲入細(xì)胞溶酶體內(nèi)被水解為游離氨基酸，導(dǎo)致溶酶體內(nèi)因滲透壓改變而破裂，釋放出的酶類物質(zhì)可引起細(xì)胞溶解。用該法可溶解含溶酶體的細(xì)胞，如單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和成纖維母細(xì)胞等，B細(xì)胞和大多數(shù)T細(xì)胞因缺乏溶酶體酶，因而不受影響。該法去除單核細(xì)胞后，約99%的單個核細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，活性大于95%。E花環(huán)降法尼龍棉分離法免疫磁珠分離法（二）淋巴細(xì)胞亞群的分離淋巴細(xì)胞是復(fù)雜的不均一的細(xì)胞群體，它包括了許多形態(tài)相似而表面標(biāo)志和功能各異的細(xì)胞群和亞群。根據(jù)細(xì)胞的表面標(biāo)志和功能等不同，借助多種方法分離淋巴細(xì)胞亞群。T細(xì)胞（CD2/LFA2/E受體）＋綿羊紅細(xì)胞SRBCE花環(huán)比重增加Ficoll-Hypaque分離液分離低滲（裂解SRBC）1.E花環(huán)沉降法成熟的T細(xì)胞表面表達(dá)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)受體，即E受體。T細(xì)胞能與SRBC結(jié)合形成E花環(huán)，而B細(xì)胞則不能。該方法簡便易行，所獲細(xì)胞的純度可達(dá)95%～99%，可同時獲得B細(xì)胞。缺點是E花環(huán)形成后可能使T細(xì)胞活化。

E花環(huán)沉降法該法簡便易行，主要用于T細(xì)胞的分離PBMC懸液與SRBC混合Ficoll法密度梯度離心收集管底細(xì)胞并低滲裂解E花環(huán)沉降法

2.尼龍棉柱分離法尼龍棉裝入5ml注射器中加入淋巴細(xì)胞懸液37℃、5％CO2、靜置1－2h預(yù)熱的含小牛血清培養(yǎng)液洗脫洗脫液中為T細(xì)胞原理B細(xì)胞可粘附尼龍毛；T細(xì)胞不具有粘附活性。該法簡便易行，不需特殊儀器，淋巴細(xì)胞活性不受影響，所獲T細(xì)胞純度可達(dá)90%以上，B細(xì)胞純度可達(dá)80%。冷培養(yǎng)液邊沖洗邊擠壓獲得B細(xì)胞

原理

將針對淋巴細(xì)胞特殊表面標(biāo)志的某種特異性單克隆抗體與磁珠結(jié)合形成免疫磁珠（IMB），當(dāng)特異性單克隆抗體與表達(dá)相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞結(jié)合，利用磁場可以將IMB所結(jié)合細(xì)胞與其他細(xì)胞分離。包被磁珠的抗體可以是第一抗體或第二抗體。3.免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法免疫磁珠細(xì)胞分選裝置全自動細(xì)胞分選系統(tǒng)488nm激光+-前向散射光檢測器

熒光檢測器電磁場單個細(xì)胞被分類進(jìn)入檢測管原理示意圖4.流式細(xì)胞術(shù)分離法流式細(xì)胞分析儀

﹡大吞噬細(xì)胞:即單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)

﹡小吞噬細(xì)胞:即中性粒細(xì)胞（抗細(xì)菌感染）吞噬細(xì)胞的種類四、吞噬細(xì)胞的分離1.特征性標(biāo)志:CD142.分離技術(shù):Pecoll密度梯度分離法流式細(xì)胞儀分離技術(shù)免疫磁珠分離法：為目前較常用的方法黏附法（一）單核細(xì)胞的分離：是指從外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中將單核細(xì)胞分離、純化出來。用Percoll分層液法或粘附去除法可獲取人外周血單核細(xì)胞，但所獲得的細(xì)胞數(shù)量較少。用流式細(xì)胞儀可自動化地對單個細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)定量測定分析，從而可分選出用特異性熒光抗體標(biāo)記的陽性細(xì)胞。其優(yōu)點是分離細(xì)胞準(zhǔn)確、快速，純度達(dá)90%～100%，回收率高，所分離的細(xì)胞可保持無菌，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性不受影響。缺點是費用昂貴，擬分離的細(xì)胞在混合群體中含量過低時，耗時較長才能獲得所需數(shù)量細(xì)胞。免疫磁珠分離法原理：

將抗體交聯(lián)于磁珠表面形成免疫磁珠（Immunomagneticbead，IMB）；加入細(xì)胞懸液，IMB上的Ab與細(xì)胞表面的Ag反應(yīng)，形成抗體/抗原的復(fù)合物；外加磁場，分選出結(jié)合有免疫細(xì)胞的IMB

。免疫磁珠分離法

☆斑蝥敷貼法分離人巨噬細(xì)胞

用斑蟊敷貼法可從人體組織滲出液中獲取巨噬細(xì)胞。用斑蟊乙醇浸液刺激前臂內(nèi)側(cè)皮膚，誘發(fā)無菌性皮炎，從皮泡滲出液中可獲取來自皮下組織中的巨噬細(xì)胞。該法獲取的巨噬細(xì)胞數(shù)量較多且純度較高，但對皮膚有一定損傷，有時可引起局部感染，應(yīng)慎用?！顒游锏木奘杉?xì)胞直接從腹腔滲出液中獲取（二）巨噬細(xì)胞的分離血中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的比例約為600～1000:1，兩類細(xì)胞密度不同，其沉降速度各異，通常用以下兩種方法分離:1.聚合物加速沉降法:可從外周血中分離出白細(xì)胞2.Ficoll分離法:可從白細(xì)胞中分離出純化的中性粒細(xì)胞（三）中性粒細(xì)胞的分離第二節(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能檢測許多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能變化。數(shù)量檢測：根據(jù)淋巴細(xì)胞及其亞群的表面標(biāo)志。功能測定：包括體內(nèi)試驗和體外試驗。淋巴細(xì)胞功能測定可分為體內(nèi)實驗和體外實驗。體內(nèi)實驗主要是間接了解淋巴細(xì)胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)；體外實驗主要包括淋巴細(xì)胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性試驗及淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力的測定T細(xì)胞（負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫功能）B細(xì)胞（執(zhí)行體液免疫功能）NK細(xì)胞（非特異性免疫作用）

一、T細(xì)胞數(shù)量及功能檢測（一）T細(xì)胞的數(shù)量檢測根據(jù)T細(xì)胞表面CD分子檢測：（1）間接熒光免疫法（2）免疫組織化學(xué)法：①酶標(biāo)（ABC法、APAAP法）②金標(biāo)法（即IGSS法）間接熒光免疫法（二）T細(xì)胞功能檢測T細(xì)胞增殖試驗：形態(tài)學(xué)法、3H-TdR摻入法、MTT法CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗：51Cr釋放法抗原特異性T細(xì)胞定量檢測：MHC-抗原肽四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測：流式細(xì)胞術(shù)體內(nèi)試驗：結(jié)核菌素試驗、PHA皮膚試驗1.T細(xì)胞增殖試驗T細(xì)胞在體外受到有絲分裂原或抗原的刺激后，細(xì)胞的代謝和形態(tài)發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，發(fā)生一系列增殖反應(yīng)，如細(xì)胞變大、胞質(zhì)增多、胞質(zhì)現(xiàn)空泡、核染色質(zhì)疏松、核仁明顯，并轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞。因此，淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)又稱淋巴細(xì)胞母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。PBMCPHA5％CO2、

37℃培養(yǎng)72h細(xì)胞涂片染色顯微鏡檢查該法簡便易行、容易在基層推廣，但主觀因素影響大。形態(tài)學(xué)法T細(xì)胞增殖試驗淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物:PHA細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松T淋巴細(xì)胞增殖試驗

轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞過渡型細(xì)胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征常用刺激物體外刺激T細(xì)胞增殖反應(yīng)的刺激物包括植物血凝素(PHA)刀豆素A(ConA)美洲商陸(PWM)白喉類毒素破傷風(fēng)類毒素純化蛋白衍生物(PPD)白色念珠菌形態(tài)學(xué)檢查法3H-TdR摻入法MTT比色法淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的檢測方法分離PBMC，與適量PHA混合，置37℃培養(yǎng)72h。取培養(yǎng)細(xì)胞作涂片染色，借助光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測。根據(jù)細(xì)胞的大小、核與胞質(zhì)的比例、胞質(zhì)的染色性以及有無核仁等特征，分別計數(shù)未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞，每份標(biāo)本計數(shù)200個細(xì)胞，按公式計算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。形態(tài)學(xué)檢查法淋轉(zhuǎn)實驗轉(zhuǎn)化率在一定程度上可反映細(xì)胞免疫功能，正常人的T細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為60%～80%，小于50%可視為降低。優(yōu)點：形態(tài)學(xué)方法簡便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實驗室應(yīng)用。缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。

原理：刺激物37℃56hG1期→S1期

合成DNA↑

3H-TdR37℃16hDNA-3H-TdR測淋巴細(xì)胞內(nèi)放射量（cpm）計算SI判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度外周血（T）G0期3H-TdR摻入法培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞抗凝全血分離液離心過濾測量放射性3H-TdR摻入法靈敏度高客觀性好

刺激指數(shù)（stimulatingindex，SI）

SI=試驗管cpm均值/對照管cpm均值3H-TdR摻入法優(yōu)點：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強，重復(fù)性好。缺點：但需一定設(shè)備條件，同時還存在放射性核素污染問題。原理：外周血T細(xì)胞

PHA發(fā)生增殖

MTT含藍(lán)色甲顆粒

的T細(xì)胞

MTT

PHA

有機溶劑測吸光度（A）值

計算SI判定細(xì)胞增殖結(jié)果SI=(SI≧2具有意義)

MTT比色法原理:靶細(xì)胞抗原T細(xì)胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細(xì)胞2.T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗形態(tài)學(xué)方法：淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞計數(shù)殘留腫瘤細(xì)胞同位素法：淋巴細(xì)胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞破壞51Cr釋放測定γ射線2.方法意義：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力

放射性測定細(xì)胞毒試驗原理示意靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞分離上清（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗背景無效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞1:1效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞5:1效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞20:1細(xì)胞溶解MHC-肽四聚體技術(shù)原理

根據(jù)T細(xì)胞活化的雙識別原理，用生物工程技術(shù)將MHC分子在體外組裝，并結(jié)合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物，結(jié)合流式細(xì)胞儀定量檢測抗原特異性T細(xì)胞。T技術(shù)要點:

1.在體外將特異性抗原肽段、可溶性MHCI類分子重鏈及β2微球蛋白正確折疊，形成MHC-抗原肽復(fù)合物，并純化該復(fù)合物。2.用生物素標(biāo)記MHC-抗原肽復(fù)合物。3.生物素標(biāo)記的MHC-抗原肽復(fù)合物與熒光標(biāo)記的親和素以4:1的比例相混合，即得到熒光標(biāo)記的四聚體MHC-肽四聚體技術(shù)MHC-肽四聚體技術(shù)原理:用刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞，用蛋白轉(zhuǎn)運抑制如莫能霉素阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運方式被打亂，引起細(xì)胞因子向高爾基體積聚，用流式細(xì)胞儀便可測出淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子種類，從而確定TH1/TH2細(xì)胞的百分率。淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測分泌的細(xì)胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++

Thl和Th2分泌的細(xì)胞因子特異性抗原皮膚試驗PHA皮膚試驗體內(nèi)試驗二、B細(xì)胞數(shù)量及功能檢測（一）B細(xì)胞數(shù)量檢測根據(jù)B細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測：（1）mIg的檢測：免疫熒光、免疫組化（2）

CD分子的檢測：檢測CD19、CD20、CD21、CD22、

CD29以及CD5等（3）小鼠紅細(xì)胞受體的檢測：花環(huán)試驗（二）B細(xì)胞功能檢測B細(xì)胞增殖試驗：3H-TdR摻入法、MTT法（刺激物：小鼠用LPS；人用SPA的金黃色葡萄球菌菌體或抗IgM抗體）B細(xì)胞抗體產(chǎn)生能力檢測：溶血空斑試驗、ELISPOT溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗體內(nèi)試驗B細(xì)胞功能檢測經(jīng)典溶血空斑試驗1.SRBC致敏的B細(xì)胞與SRBC在凝膠介質(zhì)中混勻；2.抗體形成細(xì)胞(Antibodyformingcell,AFC)周圍的SRBC與AFC產(chǎn)生的抗體結(jié)合而被致敏；3.加入豚鼠新鮮補體，致敏SRBC激活補體而溶解，在AFC周圍出現(xiàn)肉眼可見的溶血空斑；4.計算溶血空斑的數(shù)目。溶血空斑試驗溶血斑補體抗血清包被綿羊紅細(xì)胞溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點法抗體產(chǎn)生B細(xì)胞抗原包被酶聯(lián)抗抗體凝膠底物顯色刺激體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、多價肺炎鏈球菌等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價，判斷受檢者體內(nèi)B細(xì)胞的功能。體內(nèi)試驗三、NK細(xì)胞數(shù)量及功能檢測（一）NK細(xì)胞數(shù)量檢測根據(jù)NK細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測：

CD分子的檢測：檢測CD3、CD56、CD16等（CD3-CD56+CD16+）

（二）NK細(xì)胞功能檢測形態(tài)學(xué)法酶釋法：LDH釋放法熒光法：時間分辨熒光免疫分析法放射性核素釋放法：51Cr釋放法、125I-UdR釋放法流式細(xì)胞術(shù)：PI染色NK靶細(xì)胞檢測熒光強度、cpm等K562細(xì)胞為人NK細(xì)胞殺傷功能檢測的常用靶細(xì)胞染色計數(shù)離心取上清測LDH或AKP測發(fā)光強度測CPM值形態(tài)法酶釋法放射性核素釋放法流式細(xì)胞術(shù)靶細(xì)胞溶解常用靶細(xì)胞:K562細(xì)胞株NK細(xì)胞活性檢測返回章目錄（一）中性粒細(xì)胞功能檢測技術(shù)（二）巨噬細(xì)胞功能檢測技術(shù)吞噬細(xì)胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。(1)接觸：隨機相遇、趨化因子的趨化作用、補體或抗體的調(diào)理作用(2)吞入：吞噬或吞飲(3)殺菌和消化作用第三節(jié)吞噬細(xì)胞功能檢測一、中性粒細(xì)胞功能檢測趨化功能檢測：體內(nèi)法（也稱皮膚窗口法）體外法（濾膜滲透法/

Boyden小室法、瓊脂糖平板法）吞噬功能檢測：（吞噬金黃色葡萄球菌或白色念珠菌）殺傷功能檢測：

溶菌法、硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原試驗（一）中性粒細(xì)胞功能檢測

1.趨化功能的檢測

2.吞噬功能的檢測

3.胞內(nèi)殺滅作用殺菌功能的檢測

體內(nèi)試驗法：皮膚窗法體外試驗法：濾膜滲透法瓊脂糖平板法1.趨化功能檢測——檢測細(xì)胞運動功能皮膚窗法：在受檢者前臂屈側(cè)中央3㎜范圍內(nèi)，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2，5，8，12，24，36小時各取樣一次，染色觀察中性粒細(xì)胞聚集開始時間、聚集程度等。健康正常人一般2～3h后開始聚集，達(dá)50～100個，6小時可達(dá)1000個以上。

中性粒細(xì)胞可在趨化因子的作用下作定向移動，運動強度反映趨化能力。

原理及技術(shù)要點

在一特制的分上下兩層的小盒，將趨化因子加入下室，待檢細(xì)胞加入上室，兩室用微孔濾膜分隔，37℃溫育數(shù)小時后，上室的中性粒細(xì)胞受下室趨化因子的吸引，由濾膜微孔進(jìn)入濾膜內(nèi)，取濾膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍鏡下觀察細(xì)胞穿越濾膜的移動距離，從而判斷其趨化功能。濾膜滲透法濾膜滲透法（Boyden小室法）中性粒細(xì)胞趨化功能檢測

－－Boden小室法BoydenChamberShietal.JImmunolMethods,1993,164:149原理及技術(shù)要點

在瓊脂糖凝膠平板的中孔加白細(xì)胞懸液，左孔加趨化因子，右孔加對照液，溫育4～8小時后，用顯微鏡測微器測定中性粒細(xì)胞向左孔的移動距離A和向右孔的移動距離B，計算趨化指數(shù)。瓊脂糖平板法趨化指數(shù)=A/B趨化指數(shù)越大，表明中性粒細(xì)胞運動功能越強

顯微鏡檢查法：中性粒細(xì)胞吞噬、殺傷葡萄球菌

2.中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測(中性粒細(xì)胞吞噬實驗）小吞實驗

中性粒細(xì)胞白色葡萄球菌顯微鏡觀察吞噬指數(shù)=NBT（硝基藍(lán)四氮唑）還原試驗

3.殺菌功能檢測原理：

中性粒細(xì)胞在吞噬殺菌過程中，能量消耗劇增，耗氧量也隨之增相應(yīng)增加，磷酸己糖旁路的代謝活性增強，6-磷酸葡萄糖脫氫酶使葡萄糖的中間代謝產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖氧化脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)槲焯?。如加入硝基藍(lán)四氮唑(NBT)，則可被吞噬或滲透到中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中，接受所脫的氫，使原來呈淡黃色的NBT還原成點狀或塊狀的藍(lán)黑色甲月替顆粒，沉積于中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中，稱NBT陽性細(xì)胞。

方法：1.抗凝血+硝基藍(lán)四氮唑（NBT），37℃孵育25min。2.推片染色、鏡檢。正常值：NBT還原試驗NBT陽性細(xì)胞7.5-15%NBT陽性細(xì)胞百分率可反映中性粒細(xì)胞殺菌功能，正常參考值為7%～15%，平均為10%。慢性肉芽腫病患者NBT陽性細(xì)胞百分率顯著降低，甚至為零。

無刺激

患兒

正常

對照

四唑氮藍(lán)試驗（NBT）PMA刺激二、巨噬細(xì)胞功能檢測炭粒廓清試驗：主要用于動物實驗吞噬功能檢測：（吞噬雞紅細(xì)胞或白假絲酵母等）促凝血活性測定：炭粒廓清試驗

正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10％炭粒。據(jù)此給小鼠靜脈注射定量印度墨汁（炭粒懸液），間隔一定時間反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。主要用于動物實驗(二)大吞實驗巨噬細(xì)胞對顆粒性抗原物質(zhì)具有很強的吞噬功能，常用雞紅細(xì)胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母細(xì)胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人巨噬細(xì)胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨噬細(xì)胞。Mф+CRBC孵育涂片、染色、鏡檢計算、吞噬率、吞噬指數(shù)吞噬率＝（吞噬CRBC的Mф

數(shù)/計數(shù)的Mф

數(shù)）×100％吞噬指數(shù)＝Mф吞噬的CRBC總數(shù)/計數(shù)的Mф

數(shù)大吞檢測（二）巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞或白假絲酵母＋孵育涂片染色鏡檢計算吞噬率和吞噬指數(shù)小結(jié)Ficoll單次密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)和磁珠分離法進(jìn)行細(xì)胞分離和數(shù)量檢測；淋巴細(xì)胞增殖試驗：常用MTT法和3H-TdR摻入法；細(xì)胞功能檢測：T細(xì)胞（增殖、殺傷、胞內(nèi)細(xì)胞因子等），B細(xì)胞（增殖、分泌抗體能力），NK（殺傷），中性粒細(xì)胞（趨化、吞噬、殺傷），巨噬細(xì)胞（吞噬功能--炭粒廓清、雞紅細(xì)胞吞噬實驗）判斷題：1.應(yīng)用密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞時，應(yīng)從血漿和紅細(xì)胞之間吸取乳白色的單個核細(xì)胞。2.用密度梯度離心法分離外周血中血細(xì)胞，離心后可見管內(nèi)分為四層，自上而下依次為血漿、單個核細(xì)胞、分離液、粒細(xì)胞及紅細(xì)胞。3.玫瑰花結(jié)實驗可用于B淋巴細(xì)胞的計數(shù)。4.抽取血清時，一般應(yīng)選擇清晨空腹抽血，抽出的血中應(yīng)加入抗凝劑防止血液凝固。選擇1.用淋巴細(xì)胞分層液進(jìn)行密度梯度離心，所需的單個核細(xì)胞位于A．血漿與分層液之間B．分層液與粒細(xì)胞之間C．血漿與粒細(xì)胞之間D．位于最底層E．以上四種情況都可能發(fā)生2.硝基四氮唑藍(lán)還原試驗用以檢測細(xì)胞殺傷功能，這種細(xì)胞是

A．巨噬細(xì)胞B．中性粒細(xì)胞C.單核細(xì)胞D.嗜酸性粒細(xì)胞E．B細(xì)胞3.玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞指的是A.B淋巴細(xì)胞B．T淋巴細(xì)胞C．紅細(xì)胞D.粒細(xì)胞