微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查-課件

微生物學與免疫學教研室醫(yī)學微生物學實驗微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查【基本要求】1.進微生物實驗室必須穿好白大衣，離室需脫下反折。2.實驗無關物品一律禁止帶入實驗室。嚴禁在實驗室進食、飲水和喧嘩打鬧。3.手拿培養(yǎng)物后或出實驗室前要洗手；避免有菌材料濺出；破損器材及時處理并報告。4.實驗操作過程中產生的廢料要扔在指定容器內；實驗完畢清理臺面，值日生認真打掃衛(wèi)生，關閉水電，門窗，洗手后離開實驗室。2微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查1.實驗室生物安全；“有菌意識，無菌操作觀念”的樹立。2.細菌的人工培養(yǎng)以及細菌的形態(tài)學檢查（革蘭染色）。3.細菌在自然界的分布，消毒滅菌及理化因素對細菌的影響。

內容微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查細菌的人工培養(yǎng)微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查二、細菌的人工培養(yǎng)

培養(yǎng)細菌的目的，是從不純的被檢材料中找出特定的細菌或全部細菌，這一過程稱為分離培養(yǎng)。如果只是培養(yǎng)性質明確的一種細菌，則稱為純培養(yǎng)。為了從被檢材料中分離出所要檢查的細菌，可以利用多種性質不同的選擇性培養(yǎng)基，檢查各種不同的目的細菌。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查細菌的培養(yǎng)基：（一）培養(yǎng)基的定義：培養(yǎng)基是人工方法配制的含有細菌生長繁殖所需物質的營養(yǎng)基質。其必須本身無菌，一般PH調至7.2~7.6。營養(yǎng)物質水碳源氮源無機鹽生長因子微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查（二）制備原則:1.調配營養(yǎng)物質：蛋白胨（氮源），牛肉膏，氯化鈉，蒸餾水。2.調配PH：加入緩沖劑，保持PH穩(wěn)定。3.消毒滅菌。滿足a充足的營養(yǎng)物質b合適的PH值c無菌就可制成基礎培養(yǎng)基微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查液體培養(yǎng)基+1.5~2.5%瓊脂固體培養(yǎng)基+0.3~0.5%瓊脂半固體培養(yǎng)基（三）分類：1、按物理性狀分類：大量繁殖細菌觀察細菌動力短期保存菌種細菌的分離和純化微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查

液體培養(yǎng)基固體斜面培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體平板培養(yǎng)基微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查2、按用途分：(1).基礎培養(yǎng)基：含有大多數(shù)細菌生長所需要的基本營養(yǎng)成分。最常用的為肉湯培養(yǎng)基(2).增菌培養(yǎng)基：在基礎培養(yǎng)基中添加生長因子（eg:血清等）或微量元素等其他營養(yǎng)物質或特殊抑制劑。

如血平板：5-10%脫纖維羊/兔血，（60°C左右加入血）。巧克力平板:80°C左右加入血。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查(3).選擇培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入某種/些化學物質，能抑制某類細菌生長而使另一類細菌生長，從而將后者選擇出來。

常用于腸道致病菌的分離與選擇培養(yǎng)。(4).厭氧培養(yǎng)基：用于厭氧菌的分離、培養(yǎng)和鑒定。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查血平板巧克力平板MacConkey平板X.L.D平板Sabourand平板Mycosel平板幾種常用培養(yǎng)基微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查(5).鑒別培養(yǎng)基：根據(jù)各種細菌分解糖類和蛋白質的能力及代謝產物不同，在培養(yǎng)基中加入底物和指示劑來鑒別細菌。1）藍色半固體培養(yǎng)基2）無色半固體培養(yǎng)基3）基礎液體培養(yǎng)基（溴麝香草酚藍）（醋酸鉛）微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查鑒別培養(yǎng)基細菌動力鑒別細菌生化反應鑒別微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查三、各種培養(yǎng)基的接種在醫(yī)療實踐中或微生物試驗中防止周圍環(huán)境中的微生物污染操作對象，同時防止操作對象的微生物污染周圍環(huán)境。1.四種接種方式：接種針用于穿刺接種細菌（半固體培養(yǎng)基），接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的細菌接種。（相對無菌）

2.任何一個實驗，操作前均應在器皿上做標記：時間，菌種，組別。培養(yǎng)皿一般標記在皿底。一）無菌操作微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查接種環(huán)的灼燒滅菌先將環(huán)端燒熱，將接種環(huán)提起垂直放在火焰上，燒紅，環(huán)斜放，沿環(huán)向上，至金屬桿，再移向環(huán)端。來回通過火焰3次，冷卻。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查3．接種。注意：整個實驗操作過程都要非常小心，不要碰翻酒精燈，以免燒傷。（1）用左手大姆指、食指、中指和無名指拿住菌種試管，右手擰松棉塞、不取下。接種管宜放在菌種管上面（2）右手拿接種環(huán)，在火焰上燒灼滅菌，特別是箍處。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查（3）火焰邊取下兩個棉塞，不能放下；燒灼管口一周。（4）將接種環(huán)伸入試管內，冷卻后，輕輕挑取少量菌體，立即將接種環(huán)抽出。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查（6）抽出接種環(huán)后，燒管口，塞棉塞，接種環(huán)滅菌。（5）火焰旁將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸到斜面培養(yǎng)基的底部，由里向外畫蛇形細線，線要畫得細些。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查（二）接種方法1.平板劃線接種法：目的：使混合的細菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌。方法：1）連續(xù)劃線法：適用于樣本含細菌量少，如血液標本2）分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標本，如糞便標本微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查固體平板培養(yǎng)基微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查2.固體斜面培養(yǎng)基接種法：作用：觀察細菌的培養(yǎng)特性、生化反應、保存菌種。接種方法：連續(xù)劃線法。生長現(xiàn)象：呈菌苔樣生長。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查3.半固體培養(yǎng)基接種法：11作用：檢測細菌動力、生化反應接種方法：接種針穿刺法---用接種針中央直刺，一條線路，底部留空生長現(xiàn)象：沿穿刺線生長----無動力沿穿刺線擴散生長（呈云霧狀或羽毛狀）---有動力微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查4.液體培養(yǎng)基接種法作用：增菌及檢測生化反應。接種方法：研磨接種。生長現(xiàn)象：渾濁、沉淀、菌膜樣生長。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查細菌培養(yǎng)法一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：★培養(yǎng)溫度：37℃（采用恒溫培養(yǎng)箱）★培養(yǎng)時間：18～24h微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查實驗一細菌的人工培養(yǎng)一、細菌在自然界的分布1.空氣中細菌的檢查：每班兩個血平板，標記方法：在室內選擇一處放一個平皿，揭開皿蓋，暴露放置10min，即蓋上皿蓋，放入37℃溫箱培養(yǎng)24小時，觀察結果。

微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查2.人體表面細菌的檢查---手指（每組1個平皿）方法：取一普通平皿培養(yǎng)基，一部分標記“前”，另一部分標記“后”，然后將手指在標記“前”的部分沾一下，洗手后在標記“后”的部分沾一下。放入37℃溫箱培養(yǎng)24h后觀察細菌的生長情況。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查3.人體內部細菌的檢查--咽喉部方法：用“咳碟法”進行檢查，取一個血瓊脂平皿培養(yǎng)基，打開平皿蓋，置于口腔前約10cm，對著平皿咳嗽幾次，標記時間，姓名，然后放入37℃溫箱培養(yǎng)24h后觀察菌落特征。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查二、外界因素對細菌的影響：1.物理因素對細菌的影響：

紫外線：全班兩份普通平板：一組大腸桿菌，一組葡萄球菌，比較紫外線對G+，G-的抑制作用。方法：取普通瓊脂平皿，用用密集劃線法接種細菌，然后將平皿蓋遮蓋一半，用紫外線照射30min，然后放入37℃溫箱中孵育24h后觀察。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查2.化學消毒劑：每組普通平板1個，密集劃線法。

用鑷子取無菌圓形濾紙片，蘸消毒藥液（75％酒精、84消毒液或碘酒），當濾紙片被提出消毒液面后，應與化學消毒劑瓶口接觸停留去除多余藥液，然后將其貼在已接種有細菌的平板表面，貼上后用鑷子輕輕壓一下濾紙片。紙片要平整，各片之間距離要大致相等。每浸一種藥液，鑷子要滅菌使用。

37℃孵育24h，明天觀察抑菌環(huán)情況。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查3、抗生素密集劃線法操作同化學消毒劑青霉素鏈霉素慶大霉素青霉素慶大霉素鏈霉素微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查三、細菌的生化實驗：1.葡萄糖發(fā)酵試驗：藍色半固體培養(yǎng)基對面兩小組，一組大腸桿菌，一組葡萄球菌2.吲哚試驗：液體培養(yǎng)基，三菌均可。3.硫化氫試驗：半固體無色培養(yǎng)基。兩小組大腸桿菌，兩小組葡萄球菌，四小組變形桿菌。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查四、增殖細菌：斜面培養(yǎng)基，三菌均可。各組分開，G+，G-。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.接種操作為什么一定要在火焰旁邊進行？答：空氣中存在有大量的微生物，而接種燈的火焰旁能形成一個無菌區(qū)域，在這里操作，可以避免雜菌污染。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查Thankyouforyourattention！微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查今天大家首先觀察一下昨天接種的細菌的生長情況微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查1、液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象混濁：大多數(shù)細菌沉淀：多見于鏈狀排列的細菌菌膜：多見于專性需氧菌菌膜菌沉淀均勻渾濁對照微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查2、半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有鞭毛細菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外擴散生長，穿刺線邊緣模糊。無鞭毛細菌：只沿穿刺線生長，穿刺線邊緣清晰。A、有動力B、無動力C、空白對照微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查3、細菌在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌落：指單個細菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單一肉眼可見的細菌集團。

特征：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性。菌落與菌苔菌苔：指多個菌落融合在一起形成的細菌堆積物。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查一、細菌在自然界的分布：1.空氣中細菌的分布空氣中攜帶有微生物的氣溶膠粒子在地心引力的作用下，自然垂直沉降到瓊脂培養(yǎng)基上。意義：1）通過細菌的菌落數(shù)來評估空氣中細

菌的含量2）通過菌落的形態(tài)來鑒別細菌的種類3）通過本實驗樹立有菌和無菌觀念微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查2.手指細菌的分布微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查3.咽喉部細菌的分布（先觀察有無菌落）上呼吸道是開放性的通道，一般寄居著一定數(shù)量和一定種類的微生物，它們在宿主和外環(huán)境的影響下保持著微生態(tài)的平衡。

呼吸道咽部常駐菌群種類較多，正常人咽部需氧菌中，甲型鏈球菌檢出率最高，其次是奈瑟球菌屬和表皮葡萄球菌。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查二、理化因素對細菌的影響

1.物理因素對細菌的影響---紫外線

原理：紫外線主要作用于DNA，使一條DNA鏈上相鄰的兩個胸腺嘧啶以共價鍵結合成二聚體，從而干擾DNA的復制與轉錄導致細菌變異或死亡。

特點：殺菌能力強，而穿透能力弱。普通玻璃、紙張、水蒸氣、塵埃等均能阻擋。

應用范圍：紫外線滅菌法常用于消毒物體表面，手術室、無菌實驗室、傳染病房的空氣消毒及不耐熱物品消毒。

有無選擇性？微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查（1）機制①促進菌體蛋白質變性或凝固。②干擾細菌酶系統(tǒng)和代謝。③損傷細菌的細胞膜，影響細菌的化學組成，物理結構和生理活動，從而發(fā)揮防腐、消毒滅菌作用。有些化學藥品濃度高時能殺滅病原微生物，稱為化學消毒劑；濃度低時能抑制細菌生長，稱為防腐劑。2.化學因素對細菌的影響---化學消毒劑微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查（2）化學消毒劑分類（1）高效消毒劑殺滅細菌芽胞在內的所有微生物，適用于不耐熱力滅菌但要進入人體內部的物品，如內窺鏡等。次氯酸鈉、過氧化氫、甲醛、環(huán)氧乙烷等。（2）中效消毒劑不能殺滅芽胞，但能殺滅繁殖體、真菌和大多病毒，如喉鏡，麻醉器材。碘酊、乙醇等。（3）低效消毒劑能殺滅大多細菌繁殖體，但不能殺滅芽胞，結核桿菌及某些抵抗力強的真菌和病毒。新潔爾滅、洗必泰、高錳酸鉀等。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查75％酒精

碘酒

84消毒液

G+菌：+/-+++++G-菌：

-++++微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查青霉素-盤尼西林弗萊明1928弗萊明、錢恩、弗羅里于1945年共同獲得諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。青霉素是由青霉、曲霉等屬真菌產生的一種抗生素。青霉素是人類發(fā)現(xiàn)的第一種能夠治療人類疾病的抗生素。但青霉素能引起某些受藥者過敏反應，嚴重時可引起休克、甚至死亡，故應用前必須做皮膚試驗。2.化學因素對細菌的影響---抗生素微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查陽性三）生化試驗：分解色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚

吲哚試劑（對二甲基氨基苯甲醛）大腸桿菌＋變形桿菌－1、吲哚試驗微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查2.葡萄糖發(fā)酵試驗：藍色半固體培養(yǎng)基對面兩小組，一組大腸桿菌，一組葡萄球菌結果：大腸桿菌組:變黃，云霧狀生長葡萄球菌組:紫色變淺？。黃色(PH<6.0);指示劑:1％溴麝香草酚藍

藍色(PH>7.6)

微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查糖發(fā)酵試驗微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查3、硫化氫試驗（+）含硫氨基酸硫化氫黑色硫化物+鐵離子或鉛離子微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查二、今天的實驗內容：觀察細菌形態(tài)，進行形態(tài)學測定。細菌用上次實驗接種在平板或斜面培養(yǎng)基的結果。普通光學顯微鏡的分辨率為0.25μm,油鏡可放大1000倍。一般細菌都大于0.25μm，球菌達到0.8~1.2μm，故可用普通光學顯微鏡觀察。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查2、

油鏡使用方法光源：由弱到強光，檢查時用最強光集光器：下弱上強，故調到最上方選擇油鏡頭：1000倍，垂直固定。標本片滴香柏油（用完放好），固定，粗螺旋調鏡臺，至稍微接觸玻片后，換細準焦螺旋微調。標本：觀察細菌大小，形態(tài)，G+/G-，排列。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查物鏡工作距離(mm)低倍目鏡10×5.40高倍目鏡40×0.39油鏡頭100×0.11微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查3、細菌染色標本制備的基本步驟：1）涂片：原則---均勻適量。液體培養(yǎng)基直接涂，固體半固體先滴半滴生理鹽水，然后蘸適量研磨，加入呈渾濁即可。2）自然干燥（酒精燈旁可加快干燥過程）3）火焰固定：過酒精燈火焰3-4次殺死細菌，染料能著色；細胞壁通透性增加，便于著色；菌附著于玻片，不被洗掉。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查革蘭染色

革蘭染色法由丹麥病理學家ChristainGram于1884年創(chuàng)立，是細菌學中很重要的鑒別染色法，通過此法染色，可將細菌鑒別為革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）兩大類。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查革蘭染色原理原理：革蘭陽性細菌的肽聚糖層較厚，經乙醇處理后使之發(fā)生脫水作用而使孔徑縮小，結晶紫與碘的復合物保留在細胞內而不被脫色；革蘭陰性細菌的肽聚糖層很薄，脂肪含量高，經乙醇處理后部份細胞壁可能被溶解并改變其組織狀態(tài)，細胞壁孔徑大，不能阻止溶劑透入，因而將結晶紫與碘的復合物洗去而被脫色。微生物實驗細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)學檢查4)染色：革蘭染色法（Gram染色）染液組成：結晶紫染液、盧戈氏碘液、95％乙醇、稀釋復紅染色方法：結晶紫初染盧戈氏碘液媒染95％乙醇脫色稀釋復紅復染1滴1分鐘30S1分鐘影響革蘭染色的關鍵步驟是脫色水沖洗細水，玻片斜放，甩水珠水沖洗水沖洗30S水沖洗濾紙吸干滴油鏡檢微生物實驗細菌的人