生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)培訓(xùn)課件

生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)植物體細(xì)胞雜交的意義有性雜交是植物遺傳改良的一種傳統(tǒng)手段。作用空間：主要限于種內(nèi)的品種之間。

種及種以上分類(lèi)單位之間的雜交，例如種間或?qū)匍g雜交，則常常遭遇有性不親和性障礙。2生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

在無(wú)性繁殖植物和性不育植物中，如在馬鈴薯、甘薯、木薯、甘蔗和香蕉中，更是難以通過(guò)有性雜交進(jìn)行遺傳改良。因此，建立在原生質(zhì)體全能性基礎(chǔ)上的體細(xì)胞雜交和胞質(zhì)雜交技術(shù)，對(duì)于植物的遺傳改良具有重要的意義。3生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)體細(xì)胞雜交（somatichybridization):在離體條件下通過(guò)兩個(gè)親本體細(xì)胞原生質(zhì)體的融合以及隨后將融合產(chǎn)物培養(yǎng)成雜種植株的過(guò)程。1972年，Carlson首次獲得粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的細(xì)胞雜種，這也是第一個(gè)植物體細(xì)胞雜種。

4生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

1978年梅爾徹斯(Melchers)等首次獲得了番茄和馬鈴薯的屬間體細(xì)胞雜種——“Potamato”。

5生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

6生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體融合7生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)白菜—甘藍(lán)8生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)體細(xì)胞雜交步驟：1原生質(zhì)體的制備2原生質(zhì)體的融合3雜種細(xì)胞選擇4雜種細(xì)胞培養(yǎng)5由愈傷組織再生植株6雜種植株的鑒定9生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)雜交的兩個(gè)細(xì)胞用纖維素酶、果膠酶處理細(xì)胞壁原生質(zhì)體Ａ、Ｂ經(jīng)離心、振動(dòng)、電刺激用聚二乙醇（ＰＥＧ）誘導(dǎo)融合后的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁雜種細(xì)胞脫分化細(xì)胞分裂愈傷組織雜種植株再分化（植物體細(xì)胞融合完成的標(biāo)志）植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)10生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2原生質(zhì)體融合2.1自發(fā)融合2.2誘發(fā)融合2.2.1NaNO3處理2.2.2高PH-高濃度鈣離子處理2.2.3PEG（聚乙二醇）處理2.2.4電融合11生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2原生質(zhì)體融合2.1自發(fā)融合在酶解細(xì)胞壁的過(guò)程中，有些相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體(homokaryon)，每個(gè)同核體包含2～40個(gè)核。

形成的原因：由不同細(xì)胞間胞間連絲的擴(kuò)展和粘連造成的。

減少自發(fā)融合的措施：在用酶液處理之前，使細(xì)胞受到強(qiáng)烈的質(zhì)壁分離藥物的作用，切斷胞間連絲。

12生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2原生質(zhì)體融合

2.2誘發(fā)融合2.2.1NaNO3處理1909年，Kuster在一個(gè)發(fā)生了質(zhì)壁分離的表皮細(xì)胞中，低滲NaNO3溶液可以引起2個(gè)亞原生質(zhì)體的融合。缺點(diǎn)：異核體(heterokaryon)形成頻率不高。

13生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2原生質(zhì)體融合2.2.2高PH-高濃度鈣離子處理1973年，Keller和Melchers，用強(qiáng)堿性(PH10.5)的高濃度鈣離子（50mmol.L-1)溶液在37℃下處理約30min，兩個(gè)品系的煙草葉肉原生質(zhì)體很容易融合。但對(duì)于有些原生質(zhì)體系統(tǒng)，這樣高的PH值是有毒的。

14生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2原生質(zhì)體融合2.2.3PEG(聚乙二醇)處理PEG的作用機(jī)理：Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合。另外，PEG能增加類(lèi)脂膜的流動(dòng)性，也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。15生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2原生質(zhì)體融合2.2.3PEG(聚乙二醇)處理PEG作為融合劑的優(yōu)點(diǎn):①異核體形成的頻率高，可重復(fù)性強(qiáng)，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞低毒；②形成雙核異核體的頻率高。16生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2原生質(zhì)體融合2.2.3PEG(聚乙二醇)處理?yè)?jù)Burgess和Flenming（1974年）報(bào)道：在37℃下用高鈣離子的強(qiáng)堿性溶液處理時(shí)，產(chǎn)生的聚集體很大，每個(gè)包含很大原生質(zhì)體。以PEG為融合劑時(shí)，多數(shù)聚集體包含2～3個(gè)原生質(zhì)體。17生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2原生質(zhì)體融合2.2.3PEG

(聚乙二醇)處理融合基本過(guò)程

18生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2原生質(zhì)體融合2.2.3PEG(聚乙二醇)處理注意事項(xiàng)：①PEG的分子量（MW1500～6000）

②酶溶液濃度③原生質(zhì)體來(lái)源④PEG的稀釋逐步進(jìn)行⑤在PEG溶液中，加入鈣離子可以提高融合效率）

19生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2原生質(zhì)體融合2.2.3PEG(聚乙二醇)處理⑥高溫（35～37℃）⑦4%～5%（V/V）的原生質(zhì)體懸浮液⑧所用酶種類(lèi)和濃度，一般用崩潰酶。⑨材料預(yù)培養(yǎng)⑩融合地點(diǎn)（在離心管中，在小液滴中）⑾在PEG溶液中的保溫時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)降低異核體形成頻率。20生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2原生質(zhì)體融合2.2.4電融合將一定密度的原生質(zhì)體懸浮液置于一個(gè)融合小室中，小室兩端有電極，在不均勻的交變電場(chǎng)的作用下，原生質(zhì)體彼此靠近，在兩個(gè)電極間排列成串珠狀。這時(shí)，如果有足夠強(qiáng)度的電脈沖，就可以使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，從而導(dǎo)致融合。21生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)兩個(gè)電極間串珠狀原生質(zhì)體22生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)23生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)細(xì)胞電融合儀24生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2.3融合產(chǎn)物的細(xì)胞學(xué)

在膜融合以后的數(shù)小時(shí)內(nèi)，2個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)混在一起，形成一個(gè)雙核異核體。在雙親親緣關(guān)系較近的異核體中，兩個(gè)核有可能同步進(jìn)行第一次有絲分裂，而且在這個(gè)過(guò)程中，二者的染色體被一個(gè)共同的紡錘體所牽引，在有絲分裂末期形成兩個(gè)雜種子細(xì)胞。最終分化出體細(xì)胞雜種，其核內(nèi)具有雙親的染色體組。25生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)2.3融合產(chǎn)物的細(xì)胞學(xué)

在雙親親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)的雜種細(xì)胞中，兩個(gè)來(lái)源不同的染色體組常常不能完全結(jié)合在一起。在動(dòng)物體細(xì)胞雜種細(xì)胞系中，已知雙親之一的染色體會(huì)逐漸消除，在植物中也看到這種現(xiàn)象。26生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)3雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)3.1根據(jù)物理特性選擇3.2突變互補(bǔ)選擇3.3根據(jù)生長(zhǎng)和再生能力的差別選擇27生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)3.1根據(jù)物理特性選擇3.1.1根據(jù)可見(jiàn)標(biāo)志選擇

主要用于非綠色原生質(zhì)體與含有葉綠體的原生質(zhì)體的融合。（半綠半白）3.1.2根據(jù)熒光標(biāo)記選擇

將2種原生質(zhì)體群體分別用不同的熒光染料標(biāo)記，然后通過(guò)熒光顯微鏡鑒別異核體。3.1.3低密度植板選擇

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行追蹤選擇。

28生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)3.2突變互補(bǔ)選擇3.2.1隱性突變互補(bǔ)選擇3.2.2顯性抗性互補(bǔ)選擇3.2.3隱性突變與野生型互補(bǔ)選擇3.2.4顯-隱性雙突變體選擇

29生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)3.3根據(jù)生長(zhǎng)和再生能力的差別選擇

3.3.1根據(jù)愈傷組織生長(zhǎng)差別選擇在曼陀羅和煙草種間體細(xì)胞雜交以及在小麥和某些其他禾谷類(lèi)植物屬間體細(xì)胞雜交中，發(fā)現(xiàn)雜種愈傷組織表現(xiàn)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象，因此融合處理后只要挑選生長(zhǎng)快、長(zhǎng)的最大的愈傷組織，就會(huì)從中分化出體細(xì)胞雜種。

31生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)3.3根據(jù)生長(zhǎng)和再生能力的差別選擇

3.3.2植株再生能力的差別選擇不同來(lái)源的原生質(zhì)體分化再生植株的能力不同。在體細(xì)胞雜交中，只要有一個(gè)親本的原生質(zhì)體能夠再生植株，融合產(chǎn)生的雜種細(xì)胞就能再生植株。

32生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)3.3根據(jù)生長(zhǎng)和再生能力的差別選擇

3.3.3根據(jù)生長(zhǎng)和分化對(duì)培養(yǎng)基要求的差別選擇不同來(lái)源的原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分和激素的要求不同。設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基只有雜種細(xì)胞能夠生長(zhǎng)。33生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)4胞質(zhì)雜交和胞質(zhì)雜種有性雜交，細(xì)胞質(zhì)基因組來(lái)源于母本。體細(xì)胞雜交，雜種有兩個(gè)親本的細(xì)胞質(zhì)基因組。胞質(zhì)雜種(cybrid):兩種來(lái)源不同的核外遺傳成分（細(xì)胞器）與一個(gè)特定的核基因組結(jié)合在一起。核質(zhì)雜種(nucleo-cytoplasmichybrid):

一個(gè)親本的細(xì)胞核與另一個(gè)親本的細(xì)胞質(zhì)基因組結(jié)合。

34生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)4胞質(zhì)雜交和胞質(zhì)雜種獲得胞質(zhì)雜種的方法：常先把異種胞質(zhì)供體物種原生質(zhì)體的核滅活，然后再將它與異種胞質(zhì)受體物種的原生質(zhì)體融合。⑴通過(guò)射線輻照滅活胞質(zhì)供體細(xì)胞核⑵胞質(zhì)體和原生質(zhì)體的融合

35生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)4胞質(zhì)雜交和胞質(zhì)雜種⑴通過(guò)射線輻照滅活胞質(zhì)供體細(xì)胞核阻止沒(méi)融合的胞質(zhì)供體細(xì)胞的分裂，細(xì)胞核部分或完全失活。阻止沒(méi)融合的受體細(xì)胞的分裂⑵胞質(zhì)體和原生質(zhì)體的融合利用細(xì)胞質(zhì)供體細(xì)胞的去核原生質(zhì)體與受體親本的完整原生質(zhì)體融合。

36生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)5體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定5.1形態(tài)和育性鑒定5.2細(xì)胞學(xué)和分子細(xì)胞學(xué)鑒定5.3生化鑒定5.4分子生物學(xué)鑒定37生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)5體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定5.1形態(tài)和育性鑒定株型、葉形、花形，莖、葉茸毛的有無(wú)或多或少有雙親的特點(diǎn)育性取決于雙親親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，雜種或是育性很低，或是完全不育。

38生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)5體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定5.2細(xì)胞學(xué)和分子細(xì)胞學(xué)鑒定通過(guò)確定雜種染色體數(shù)和染色體形態(tài)39生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)5體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定5.3生化鑒定同工酶譜分析法：將體細(xì)胞雜種的同工酶譜與其雙親的酶譜比較：雜種植株的酶譜可能是雙親酶譜帶的總和可能只出現(xiàn)雙親的部分酶帶或缺少雙親的某些酶譜而出現(xiàn)新的譜帶。

40生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)5體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定5.4分子生物學(xué)鑒定RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)

SRAP(sequence-relatedamplifiedpolymorphism,序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性)

SSR（Simplesequencerepeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)）41生物技術(shù)概論植物體細(xì)胞雜交技術(shù)6體細(xì)胞雜種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用6.1對(duì)無(wú)性繁殖植物或性不育植物進(jìn)行遺傳重組對(duì)2個(gè)不能進(jìn)行有性繁殖的物種之間實(shí)現(xiàn)遺傳重組，體細(xì)胞融合目前看來(lái)是唯一途徑。性不育植物（單倍體、三倍體和非整倍體），融合后產(chǎn)生可育的二倍體或多倍體。42生