實(shí)驗(yàn)三血清醋酸纖維薄膜電泳

實(shí)驗(yàn)三血清醋酸纖維薄膜電泳第1頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆针娪镜幕驹?，加深對蛋白質(zhì)兩性解離性質(zhì)的理解。掌握血清醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的基本操作。第2頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)原理

第3頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳技術(shù)（Electrophoresis）

電泳的概念：帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳.正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子第4頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月背景：電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國物理學(xué)家Re?ss進(jìn)行了世界上第一次電泳實(shí)驗(yàn)）。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，是近幾十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

第5頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月為了克服溶液對電泳離子的影響，一般在電泳體系中加入不流動的固體支持物。（一）按支持物的物理性狀不同，可分為：1．濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、聚氯乙烯纖維薄膜、醋酸纖維)電泳2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3．凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4．絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。電泳的分類

第6頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）按支持物的裝置形式不同，可分為：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳

第7頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)按pH的連續(xù)性不同，區(qū)帶電泳可分為：1．連續(xù)pH電泳：即整個電泳過程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。2．非連續(xù)pH電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電脈，等電聚焦電泳等。

第8頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳速度:帶電粒子在電場中運(yùn)動時，單位電場強(qiáng)度內(nèi)粒子運(yùn)動的速度，以u表示，即

V—粒子運(yùn)動的速度X—電場強(qiáng)度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度影響電泳速度的主要因素

第9頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.樣品本身:

分子帶電量：Q越多，u越大；分子大小:分子小，r越小，u越大；

分子形狀：形狀越小，與支持物介質(zhì)摩擦 越小，u越大。形狀越規(guī)則，u越大，反之則越小。球形分子>纖維狀分子第10頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月2.緩沖溶液：A.pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大B.離子強(qiáng)度(I)：離子強(qiáng)度代表所有類型的離子所產(chǎn)生的靜電力，也就是全部的離子效應(yīng)，它取決于離子電荷的總數(shù)，而與溶液中鹽類的性質(zhì)無關(guān)。溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電質(zhì)點(diǎn)的泳動速度越慢；離子強(qiáng)度越低，質(zhì)點(diǎn)泳動的速度越快。一般離子強(qiáng)度的選擇范圍在0.02～0.2之間。第11頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月3.電場強(qiáng)度(X):

電場強(qiáng)度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。注意：電場強(qiáng)度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。在進(jìn)行高壓電泳的時候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變性而無法分離。第12頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳緩沖液相對于固體支持物的移動稱電滲。如紙電泳時，濾紙吸附OH-帶負(fù)電荷，與紙接觸的緩沖液帶正電荷向負(fù)極移動，會對顆粒的移動造成不良影響，故電泳時，電滲小些為好。4．電滲現(xiàn)象第13頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月醋酸纖維薄膜電泳第14頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月

醋酸纖維是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙?；伞Ｍ磕ǔ删鶆虻谋∧t成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，有強(qiáng)滲透性，厚度約為120微米。

醋酸纖維素薄膜電泳有以下優(yōu)點(diǎn)：微量、快速、簡便、分辨力高、對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象

第15頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)原理以蛋白質(zhì)為例：pH>pIpH=pIpH<pIH＋H＋OH－OH－蛋白質(zhì)兼性離子蛋白質(zhì)陽離子蛋白質(zhì)陰離子（等電點(diǎn)）實(shí)驗(yàn)原理以蛋白質(zhì)為例：實(shí)驗(yàn)原理第16頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月人血清中幾種主要蛋白組分血清蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分子量占總蛋白的％清蛋白4.64

69,00057～72α1－球蛋白5.06

200,0002～5α2－球蛋白5.06300,000

4～9β－球蛋白5.1290,000～150,0006.5～12γ－球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20

緩沖液pH=8.6

pH>pI血清蛋白帶負(fù)電荷,在電場中向正極移動。第17頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月

經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶第18頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月染色和定量膜條經(jīng)過氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比?？蓪⒏魃珟Ъ糸_，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計(jì)算各種蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。第19頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)步驟：1．準(zhǔn)備與點(diǎn)樣：取一條2.5×8cm的膜條充分浸透在巴比妥緩沖液中取出膜條濾紙吸去多余的緩沖液無光面距一端1.5cm處作點(diǎn)樣線點(diǎn)樣器下端粘上薄層血清垂直點(diǎn)樣第20頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月（注意：在薄膜負(fù)極端寫好學(xué)號或者做好標(biāo)記)第21頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月2．電泳放置膜條點(diǎn)樣端置于陰極點(diǎn)樣面向下膜條貼緊濾紙，拉直膜條平衡10分鐘通電電壓：160v時間：50min關(guān)閉電源第22頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第23頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月3．染色、脫色通電完畢取出膜條浸于染色液（氨基黑10B）中3min取出膜條依次浸于漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5min直至漂凈濾紙吸干薄膜第24頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第25頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月４.定量(兩人的膜條共用)取試管6支，編號1~6試管編號

Aα1α2βγ00.4mol/LNaOH

6.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml蛋白條帶清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白無蛋白區(qū)充分振蕩、脫凈染料比色、定量15min第26頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)結(jié)果：原始數(shù)據(jù)：各樣品吸光度值清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白A儀器型號：吸收波長：650nm第27頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月光密度總和T＝2A＋α1＋α2＋β＋γ1．計(jì)算出各部分蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。

清蛋白％＝（2A/∑T）×100％ α1球蛋白％＝（α1

/∑T）×100％ α2球蛋白％＝（α2

/∑T）×100％ β球蛋白％＝（β/∑T）×100％ γ球蛋白％＝（γ/∑T）×100％2．計(jì)算出清蛋白與球蛋白之比值（2A/G）

G=α1＋α2＋β＋γ第28頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月血清蛋白電泳結(jié)果的臨床意義：可能相關(guān)疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低球蛋白血癥↓*臨床上還可用A/G比來表示清球蛋白的量的關(guān)系：正常人A/G＝1.5～2.5第29頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月注意事項(xiàng)：1、點(diǎn)樣時，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。2、點(diǎn)樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。3、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過多或過少。第30頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月4