病毒類生物制品安檢和效檢-課件

病毒類生物制品安全檢驗和效力檢驗1ppt課件序言“安全、有效、穩(wěn)定、均一”是獸用生物制品質(zhì)量概念的4個核心要素，對于生物制品而言,安全和效力檢驗是所有預(yù)防用生物制品的必檢項目，也是生物制品企業(yè)質(zhì)量管理和檢驗人員最主要的日常工作。嚴格規(guī)范的試驗操作是取得真實準確的檢驗結(jié)果，保證制品質(zhì)量的前題。以下就病毒類制品的安全和效力檢驗問題與大家進行交流。2ppt課件一、常見病毒類制品的安全檢驗安全檢驗的原理及技術(shù)依據(jù)安全檢驗的一般要求安全檢驗的一般判定原則病毒類制品安全檢驗的種類和控制要點影響安全檢驗結(jié)果的主要因素安全檢驗注意事項安全檢驗的安全措施3ppt課件

安全檢驗的原理及技術(shù)依據(jù)

對人、畜及環(huán)境安全是對各類獸用生物制品最基本的要求，安全檢驗的原理就是生物制品大部分是用活的微生物制備而成，有些微生物本身就是強毒或殘余一定毒力;另外在制品生產(chǎn)過程中也可能由原材料、設(shè)備或操作過程造成外源毒素或微生物污染，如果沒有嚴格的控制手段和檢驗標準有可能對人畜和環(huán)境造成危害。因此獸用生物制品質(zhì)量標準規(guī)定：對于預(yù)防、治療用途的獸用生物制品必須進行安全檢驗。獸用生物制品安全檢驗的技術(shù)依據(jù)如下：

1、中華人民共和國獸藥典、獸用生物制品質(zhì)量標準、生物制品規(guī)程

2、企業(yè)的內(nèi)控標準

3、企業(yè)安全檢驗SOP4ppt課件安全檢驗的一般要求

1、安檢樣品：除另有規(guī)定外，每批抽3瓶混和后按照規(guī)定進行檢驗和判定；2、場地：安全檢驗應(yīng)在專用動物舍內(nèi)進行，不得在野外進行3、安檢動物：安檢動物必須符合各制品質(zhì)量標準和規(guī)程的要求4、安檢動物的飼養(yǎng)：安檢動物應(yīng)單獨飼養(yǎng)不得與效檢免疫動物及攻毒動物同舍飼養(yǎng)，以免影響檢驗結(jié)果5、特殊規(guī)定：凡生產(chǎn)口蹄疫疫苗的企業(yè)，對其生產(chǎn)的豬用活疫苗均需增加乳鼠進行安檢。凡使用豬瘟強毒或污染豬瘟強毒的生物制品企業(yè)，對其所生產(chǎn)的豬用活疫苗均需用無豬瘟抗體的敏感豬進行安檢。(避免交叉感染、散毒)5ppt課件安全檢驗的一般判定原則安檢動物在檢驗期間如有死亡時，必須及時解剖，明確原因，確屬意外死亡時，作無結(jié)果論；如檢驗結(jié)果可疑，難以判定時，應(yīng)以加倍的該種動物重檢；如不安全，則該批制品應(yīng)于報廢。凡規(guī)定用多種動物進行安檢的制品，只要有一種動物的安檢結(jié)果不符合規(guī)定，即不得出售。6ppt課件

病毒類制品安全檢驗的種類和要點

1、用本動物進行安全檢驗

用制品的靶動物進行安全檢驗是最直接最有效的安全檢驗方法，也是大部分獸用生物制品采用的方法。在用本動物進行安全檢驗時必須注意以下問題：（1）對于禽用疫苗:

a.檢驗用雞必須采用SPF雞，檢驗用雞胚必須采用SPF雞胚，其優(yōu)點是不需測定有關(guān)抗體。b.對于某些標準暫時規(guī)定采用易感禽的，在試驗前應(yīng)測定針對被檢制品抗原的特異性抗體水平，抗體效價必須符合規(guī)定的標準。在接種疫苗以后，必須及時進行觀察，特別是對于發(fā)病病程短，不以死亡作為判定標準的制品（如法氏囊、傳支等疫苗）標準規(guī)定必須解剖的制品，必須在規(guī)定的時間內(nèi)進行解剖和判定，需要進行傳代的，應(yīng)采集病料按規(guī)定進行傳代。（2）對于哺乳類動物疫苗，在接種前應(yīng)測定針對被檢制品抗原的特異性抗體水平，抗體效價必須符合規(guī)定的標準。

a.在接種疫苗以后，如規(guī)定某些觀察和測定指標的（如體溫、局部反應(yīng)、肌體狀態(tài)、食欲變化等），必須按規(guī)定全面測定和觀察，并及時詳細記錄。

b.對于某些規(guī)定的特殊判定標準（如羊痘活疫苗，需測定痘腫反應(yīng)大?。瑧?yīng)及時準確測量并記錄具體數(shù)據(jù)。7ppt課件2、用實驗動物進行安全檢驗有的制品標準規(guī)定可以用試驗動物進行安全檢驗如牛瘟活疫苗（用小白鼠和豚鼠進行檢驗）偽狂犬滅活疫苗（用家兔進行檢驗）這種檢驗方法較少采用，其特點是試驗動物比本動物更為易感，而且試驗動物均可表現(xiàn)出特異性的臨床癥狀。對于該類試驗觀察要點是特異性的臨床癥狀8ppt課件3、用本動物和實驗動物同時進行安全檢驗

用本動物和試驗動物同時進行安全試驗，是大多數(shù)哺乳類動物用疫苗及多聯(lián)疫苗采用的方法。在這種安全試驗中：

a.小實驗動物一般承擔非特異性的安全評價指標（內(nèi)毒素、佐劑安全性等）;b.本動物承擔特異性安全評價指標;

對于這種安全檢驗，除個別產(chǎn)品的特殊規(guī)定外，一般判定原則是:所有試驗均應(yīng)符合規(guī)定，只要有一種試驗不安全，均判為產(chǎn)品不安全。9ppt課件4、特殊的安全檢驗指標

有一些產(chǎn)品，因靶病毒對不同年齡的動物致病性不同，可能規(guī)定需用不同年齡段的本動物進行安全檢驗（如孕畜、仔畜等），對于這類制品應(yīng)按規(guī)定進行檢驗。10ppt課件影響安全檢驗結(jié)果的主要因素對于病毒類制品來說，由于病毒與細菌不同：a.病毒更易受抗體及各種理化因素的影響；b.病毒類疫苗在生產(chǎn)過程中除易受細菌污染外，更易受外源病毒污染，因此潛在的不安全因素更為復(fù)雜，因此在對病毒類疫苗特別是弱毒活疫苗進行檢驗時應(yīng)注意以下幾點：（1）接種動物前及接種過程中應(yīng)注意對稀釋樣品進行冷藏，防止病毒滅活及被細菌污染。（2）必須確保試驗動物的抗體水平符合規(guī)定（3）試驗動物的年齡、品種甚至性別必須符合規(guī)定（4）某些非致死性病毒病病程較短，癥狀不典型，應(yīng)及時全面觀察，需要解剖的應(yīng)及時解剖，防止因觀察不及時造成不安全產(chǎn)品的放行。11ppt課件安全檢驗注意事項

1.為保證檢驗的公正性，避免在對安全檢驗結(jié)果判定的主觀影響，因此應(yīng)由2名檢驗員共同進行。2.為防止污染，涉及疫苗稀釋等操作步驟，應(yīng)當在無菌條件下進行。3.動物飼養(yǎng)環(huán)境要符合動物飼養(yǎng)和檢驗的要求，如果環(huán)境因素不穩(wěn)定，應(yīng)當設(shè)置合適數(shù)量的同來源動物對照。4.檢驗過程中，如出現(xiàn)發(fā)病時，要增加觀察次數(shù)，對死亡動物要及時進行解剖并進行無害化處理12ppt課件安全檢驗的安全措施

1、檢驗過程中應(yīng)注意防止對檢驗人員和環(huán)境的污染，檢驗人員必須穿戴工作服、口罩及相關(guān)的安全防護器具，撒在操作臺、地面的產(chǎn)品要及時進行原位消毒。

2、檢驗完畢后開封的產(chǎn)品均要進行高壓滅菌處理。

3、發(fā)病或死亡動物、糞便及其污染物必須嚴格按照“防止散毒”等相關(guān)規(guī)定處理。

4、懷孕或手部有外傷的檢驗人員禁止解剖死亡動物。

5、在檢驗過程中發(fā)生烈性傳染病或人員意外時，必須迅速報告有關(guān)部門采取緊急措施。13ppt課件二、病毒類制品的效力檢驗

效力檢驗的原理及依據(jù)效力檢驗的一般要求效力檢驗的一般判定原則病毒類制品效力檢驗的種類及質(zhì)量控制要點影響效力檢驗結(jié)果的主要因素效力檢驗注意事項效力檢驗的安全措施14ppt課件效力檢驗的原理及技術(shù)依據(jù)

對于獸用預(yù)防和治療類生物制品來說，效力是制品的核心質(zhì)量要素之一，效力是制品中發(fā)揮主要作用的核心成分如抗原、抗體及佐劑等效能的集中反映，效力檢驗是對以上各成分效能的綜合指標進行檢驗，是制品放行前最主要的評價指標，因此獸用生物制品質(zhì)量標準和規(guī)程規(guī)定預(yù)防和治療用生物制品必須進行效力檢驗，影響制品效力的主要因素有抗原的免疫原性、有效抗原的含量、佐劑的效能等，在現(xiàn)有的效力檢驗方法中，免疫攻毒試驗是對以上各因素進行綜合評價的最有效的直接方法，而抗原含量測定、免疫動物后的抗體效價測定等均屬于間接方法，但由于其指標與免疫攻毒保護試驗具有一定的平行關(guān)系因此可作為某些制品的效力檢驗指標。從生物制品的發(fā)展趨勢來看，由于人們對動物保護、環(huán)境和生物安全的重視，這些間接方法特別是體外評價方法是最主要的發(fā)展方向。效力檢驗的技術(shù)依據(jù)如下：

1、中華人民共和國獸藥典、獸用生物制品質(zhì)量標準、生物制品規(guī)程

2、企業(yè)的內(nèi)控標準

3、企業(yè)效力檢驗SOP15ppt課件效力檢驗的一般要求

樣品要求：a.除另有規(guī)定外一般每批疫苗任抽1瓶按規(guī)定進行檢驗；b.同批疫苗分為幾個亞批時，效力檢驗均應(yīng)按亞批分別抽樣分別檢驗，不能采用檢驗一個亞批代表其它批或幾個亞批混和效檢的方法進行檢驗。動物要求：a.應(yīng)選用同品種、體重大致相同并符合實驗動物要求的健康易感動物；b.外購動物要求來源相同,免疫前應(yīng)隔離觀察適當時間，確證符合試驗動物標準要求后方可使用。c.隔離舍內(nèi)飼養(yǎng)。接種要求：a.免疫動物和對照動物必須同時注射;b.強毒不能與免疫接種部位在同一個部位,例如左后腿接種疫苗，攻毒部位應(yīng)選右后腿。16ppt課件效力檢驗的一般判定原則

1、免疫動物中途有意外死亡或損失，如存活頭數(shù)仍能達到要求的保護頭數(shù)以上時，可以進行攻毒，攻毒后如能達到標準規(guī)定的保護頭數(shù)，可判為合格。達不到保護頭數(shù)判為不合格，不得以保護百分率作為判定依據(jù)。攻毒后不合格，應(yīng)算為一次檢驗。2、對不規(guī)律的效檢結(jié)果如本動物效檢不合格，小動物檢驗合格，應(yīng)判為不合格。3、同時做兩個稀釋度檢驗時，高稀釋度（如萬倍）合格，低稀釋度（如5000倍）不合格，判為無結(jié)果。4、攻毒對照動物死亡或發(fā)病頭數(shù)達不到規(guī)定要求，但免疫組動物符合標準時，該次檢驗判為無結(jié)果，不計算在檢驗次數(shù)內(nèi)，但必須簽在批簽發(fā)報表中。對照動物不發(fā)病死亡時，不得重復(fù)攻毒。5、重檢規(guī)定：a.規(guī)定用本動物檢驗的制品，效檢兩次不合格，應(yīng)報廢，不得進行第3次檢驗。b.規(guī)定用本動物或小動物進行效檢的制品，可用小動物檢2次，本動物檢1次，如本動物檢驗不合格，不得再用小動物進行重檢。17ppt課件病毒類制品效力檢驗的種類及質(zhì)量控制要點

病毒類制品的效力檢驗種類：

1、按照檢驗形式分為：體內(nèi)試驗和體外試驗2類，

2、根據(jù)檢驗內(nèi)容分為：攻毒保護試驗、抗原含量測定、免疫抗體測定3類。

▲對于弱毒類活疫苗多采用抗原含量測定

▲對于滅活疫苗多采用攻毒保護試驗

以下按照第二種分類方式介紹3類效力檢驗方法的質(zhì)量控制要點18ppt課件（1）攻毒保護試驗攻毒保護試驗原理：使用疫苗進行接種的最終目的是使接種過的動物獲得抵抗強毒病原感染的能力。因此，對靶動物或已經(jīng)建立的實驗動物模型進行接種后，用強毒病原進行人工攻毒，根據(jù)動物的保護情況判斷疫苗的效力，是用以檢驗疫苗效力的最直觀方法。攻毒保護試驗種類：由于效力檢驗采用的檢驗動物均為小樣本，一般不以保護百分率表示試驗結(jié)果，按照結(jié)果表示方法分為：絕對保護比例、相對保護比率、半數(shù)保護量（PD50）、保護指數(shù)（PI值）4種方法。19ppt課件a.絕對保護比例方法：主要用于采用致死性強毒進行攻擊的產(chǎn)品或發(fā)病癥狀特異、判定客觀（如新城疫滅活疫苗）等產(chǎn)品，要求對照動物全部發(fā)病死亡，免疫動物以攻毒后的絕對保護數(shù)為判定標準。（免疫7/10、對照0/5）b.相對保護比率方法：主要用于攻毒毒株毒力較弱，不一定全部發(fā)病死亡的制品，如傳染性支氣管炎（免疫6/8、對照0/4或免疫8/8對照3/4）、兔瘟滅活疫苗（免疫4/4、對照3/4））c.半數(shù)保護量（PD50）和保護指數(shù)（PI值）

半數(shù)保護量測定方法:是以不同劑量疫苗免疫動物，采用定量強毒進行攻擊，通過計算可使50%動物得到保護的疫苗免疫劑量評價制品的效力，該方法是攻毒保護試驗的定量方法，是目前為止較為科學(xué)的一種方法。目前采用該方法的產(chǎn)品主要有口蹄疫滅活疫苗、雞傳染性鼻炎、新城疫二聯(lián)滅活疫苗等。

保護指數(shù)方法:在國內(nèi)使用不普遍，主要用于致病力較弱，評價指標不十分客觀的制品，如馬立克活疫苗的攻毒保護試驗等，通過計算免疫組和對照組保護百分比的比值進行效力評價。狂犬病滅活疫苗的攻毒保護試驗，通過同時計算疫苗和參考疫苗的PD50，公式為：（疫苗的PD50/參考疫苗的PD50）×參考疫苗的IU值，每頭份應(yīng)≥2IU。20ppt課件攻毒保護試驗的質(zhì)量控制要點1、動物：必須是易感動物，在免疫前除SPF動物外，應(yīng)按要求測定抗體效價。2、免疫：免疫接種量應(yīng)準確3、攻擊用強毒：攻毒前應(yīng)準確測定毒價，在接種過程中應(yīng)注意對稀釋毒液進行低溫保存。4、試驗觀察：攻毒后應(yīng)及時觀察，有剖檢要求的應(yīng)在規(guī)定時間進行剖檢觀察，要求分離病毒的應(yīng)及時無菌采集病料。5、記錄：應(yīng)按效力檢驗SOP及時詳細記錄規(guī)定項目21ppt課件采用此方法的主要產(chǎn)品有：雞新城疫滅活疫苗、雞傳染性鼻炎-雞新城疫二聯(lián)滅活疫苗、偽狂犬病滅活疫苗、兔病毒性出血癥滅活疫苗、豬口蹄疫O型滅活疫苗、?？谔阋逴型滅活疫苗、豬瘟活疫苗(I)、豬瘟活疫苗（II）、雞傳染性喉氣管炎活疫苗、雞傳染性法氏囊病中等毒力株活疫苗、豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌三聯(lián)活疫苗、偽狂犬活疫苗、雞傳染性支氣管炎活疫苗、雞新城疫中等毒力活疫苗、雞新城疫低毒力活疫苗、雞新城疫-雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、鴨瘟活疫苗。

注：紅色字體疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。22ppt課件攻毒保護試驗效檢方法舉例牛口蹄疫O型滅活疫苗效力檢驗：用至少6月齡的健康易感牛（細胞中和抗體滴度≤1：8，或乳鼠中和抗體滴度≤1：4）15頭，分為3組，每組5頭，將待檢疫苗分為1頭份、1/3頭份、1/9頭份3個劑量組，每一劑量組分別于頸部肌肉注射5頭牛。接種21天后，連同條件相同的對照牛2頭，每頭牛舌上表面兩側(cè)分兩點皮內(nèi)注射?？谔阋逴型病毒強毒，每點0.1ml（共0.2ml，含10000ID50）。連續(xù)觀察10日。對照牛應(yīng)至少3蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍。免疫牛僅在舌面出現(xiàn)水泡或潰瘍，而其他部位無病變時判為保護，除舌面以外任一部位出現(xiàn)典型口蹄疫水泡或潰瘍判為不保護。根據(jù)免疫牛的保護數(shù)，按Reed-Muench法計算被檢疫苗的PD50，每頭份疫苗應(yīng)至少含3PD50。23ppt課件（2）抗原含量測定抗原含量測定原理：制品中的抗原含量與免疫效力一般呈平行關(guān)系，因此通過測定制品中的有效抗原含量可間接反映制品的效力。測定抗原含量的方法分為體內(nèi)和體外兩類：a.對于病毒活疫苗主要是測定病毒含量，方法主要有:動物、雞胚、細胞、血凝試驗等。其中采用動物和雞胚方法屬于體內(nèi)試驗；采用細胞和血凝試驗為體外試驗。結(jié)果表示主要有LD5O、TCID50、ELD50、PD50、EID5O）或蝕班數(shù)（PFU）、HA價等b.對于滅活疫苗的抗原含量測定，體內(nèi)試驗主要是PD50方法，體外試驗主要是一些血清學(xué)方法如ELISA等。24ppt課件病毒含量測定病毒含量測定方法：每批疫苗按瓶簽注明的頭份用指定的稀釋液作適當稀釋后，通常選擇三個最佳稀釋度，按規(guī)定的途徑和劑量接種一定數(shù)目指定的實驗動物、細胞、雞胚，在規(guī)定的時間內(nèi)觀察，根據(jù)動物反應(yīng)、細胞病變、雞胚存活數(shù)或病變數(shù)，通過計算LD5O、TCID50

、ELD50、PD50、EID5O或蝕班數(shù)（PFU），以此來判定疫苗的效力。25ppt課件

病毒含量測定常見疫苗（12種）：口蹄疫O、A型活疫苗、山羊活疫苗、雞傳染性喉氣管炎活疫苗、雞傳染性法氏囊病中等毒力株活疫苗、雞傳染性支氣管炎活疫苗、雞新城疫中等毒力活疫苗、雞新城疫低毒力活疫苗、雞新城疫、雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、雞痘活疫苗（Ⅰ）、小鵝瘟活疫苗、雞馬立克氏病活疫苗、雞馬力克氏病火雞皰疹病毒活疫苗。注：紅色字體疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。26ppt課件病毒含量測定方法舉例口蹄疫O、A型活疫苗單價苗的效力檢驗：將疫苗用PBS做10倍系列稀釋，O型苗以10-5、10-6、10-7三個個稀釋度，A型苗以10-6、10-7、10-83個稀釋度，各皮下接種3—4日齡乳鼠4只，每只0.1ml，觀察4-5日，根據(jù)乳鼠發(fā)病死亡數(shù)計算LD50，每0.1mlO型苗≥105.5LD50，A型苗≥106.5LD50，判為合格。

山羊痘活疫苗效力檢驗方法之一：按瓶簽注明頭份，用生理鹽水稀釋測其毒價，每頭份病毒含量應(yīng)≥103.5TCID50。27ppt課件

（3）免疫抗體測定免疫抗體測定的原理：主要是采用血清學(xué)試驗測定疫苗免疫動物后產(chǎn)生的保護性抗體效價，間接反映制品的效力。病毒性產(chǎn)品主要有病毒中和試驗、HI試驗、ELISA等，其中中和試驗有體內(nèi)和體外試驗兩種。HI試驗、ELISA均屬于體外試驗。28ppt課件病毒中和試驗病毒中和試驗有固定病毒稀釋血清、固定血清稀釋病毒兩種方法a.固定病毒稀釋血清法以中和抗體效價表示結(jié)果，中和抗體效價指能使50%指示動物（雞胚、細胞）得到保護的抗體稀釋度b.固定血清稀釋病毒以中和指數(shù)表示結(jié)果中和指數(shù)指試驗組LD50（LD5O、TCID50

、ELD50、PD50、EID5O

）與對照組LD50（LD5O、TCID50

、ELD50、PD50、EID5O

）的比值29ppt課件采用抗體效價測定的常見制品主要有雞產(chǎn)蛋下降綜合征滅活疫苗（HI抗體測定）、馬傳染性貧血活疫苗（補體結(jié)合試驗和瓊脂擴散試驗）法氏囊疫苗（中和抗體）。禽流感滅活疫苗等。雞新城疫-雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、小鵝瘟活疫苗、偽狂犬病滅活疫苗。注：紅色字體疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。30ppt課件抗體效價測定方法舉例雞產(chǎn)蛋下降綜合癥效力檢驗：用3-6周齡的健康易感雞（HI抗體≤1：4）10只，每只肌肉或皮下注射疫苗0.5ml,另取10只雞飼養(yǎng)不免疫；3-5周后采血，測定HI抗體，免疫雞HI抗體幾何平均滴度≥1：128，對照雞抗體HI抗體效價應(yīng)≤1：4。小鵝瘟活疫苗效力檢驗方法之一；取健康成年鵝4只，分別采血1ml,分離血清并混合備用。然后注射1個使用劑量的疫苗，每只鵝1ml，21-28日后采血，分離血清混合，將接種疫苗前后的2次血清分別與