實驗六家禽病毒性傳染病診斷技術(shù)

實驗六家禽病毒性傳染病診斷技術(shù)血凝和血凝抑制試驗（Hemagglutination

and

Hemagglutination

InhibitionAssay,

HA

and

HI）家禽病毒性傳染病診斷技術(shù)

臨床癥狀和病理變化只能作為疾病診斷的一個指征，不能作為確診的依據(jù)。病原檢測抗體檢測分子診斷鑒別診斷病毒分離鑒定病毒的分離鑒定：是確診的金標(biāo)準(zhǔn)。樣品采集培養(yǎng)系統(tǒng)分離方法病毒鑒定傳代細胞原代細胞雞胚糞便、腸內(nèi)容物泄殖腔、氣管拭子病變組織接胚離心取上清勻漿或懸浮生物學(xué)特征致病性試驗血凝試驗單抗分群

接種途徑1、絨毛尿囊膜接種（法氏囊、傳喉）2、尿囊腔接種（禽流感、新城疫、傳支）（鴨胚或鵝胚尿囊腔：鴨肝炎、鴨瘟、EDS-76）3、卵黃囊接種（法氏囊、EDS-76）4、羊膜腔接種 正粘病毒和副粘病毒（流感、腮腺炎等病毒）

尿囊腔接種主要用于正粘V和副粘V，如流感V、新城疫V的分離和增殖。1、選用9-11日齡的雞胚，畫出氣室和胚位2、在氣室接近胚體處用碘酊和酒精進行消毒3、用打孔器穿一小孔，將注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入0.1-0.2ml接種物4、用石蠟封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并檢卵一次，24h內(nèi)死亡者廢棄。絨毛尿囊膜接種主要用于痘V和皰疹V的分離和增殖。1）取10-12日齡雞胚，畫出氣室部，消毒2）在氣室端的卵殼上開一1.5×1.5cm的口3）用滅菌眼科鑷子撕去一小片內(nèi)殼膜4）滴入接種物5）用膠布或透明膠紙封閉切口

收毒收毒前將雞胚直立放置于4℃冰箱半小時以上，凍死胚胎，防止出血。根據(jù)接種途徑的不同，收獲相應(yīng)的材料1、絨毛尿囊膜接種 收獲接種部位絨毛尿囊膜2、尿囊腔接種 收獲尿囊液（5-8ml）3、卵黃囊接種 收獲卵黃囊或胚體4、羊膜腔接種 收獲羊水（0.5-1ml）一、實驗?zāi)康难脱种圃囼灥脑?。實驗操作步驟和結(jié)果判定。了解HA和HI實驗的應(yīng)用（定性，定量）。能凝集紅細胞的禽的病原禽流感病毒新城疫病毒傳染性支氣管炎病毒（胰酶，磷脂酶C）EDS76副雞嗜血桿菌雞毒支原體二、實驗原理（一）血凝試驗（HA）一些病毒能夠促使動物如雞、鵝、豚鼠和人的紅細胞發(fā)生凝集，叫做血凝試驗。HA的原理圖++++++++++-血凝試驗結(jié)果判定1:21

1:22

1:23

1:24

1:25

1:26

1:

271:28

1:29

1:210

1:211

1:212血凝價：能使紅細胞產(chǎn)生50%凝集的病毒最高稀釋度。（一個血凝單位）VaVbVcVd（二）血凝抑制試驗（HI）當(dāng)病毒懸液中加入特異性抗體時，這種紅細胞凝集的現(xiàn)象就被抑制，稱紅細胞凝集抑制試驗，即血凝抑制試驗。HI的原理圖三、實驗材料雞新城疫病毒：雞新城疫弱毒株（Lasota）接種雞胚、收獲尿囊液制備。雞紅細胞：采集健康雞血液，以阿氏液抗凝，以生理鹽水洗滌3~5次，將血漿、白細胞等充分洗去，用生理鹽水配置成1%紅細胞懸液使用。0.85%生理鹽水。被檢血清，采自被檢雞的健康血清。四、實驗步驟（一）血凝試驗（HA）1~12孔加入50μl生理鹽水;第1孔加50μl病毒懸液，倍比稀釋到第10孔；1~12孔中加入1%的紅細胞50μl；震蕩后置37℃25~30min觀察結(jié)果。病毒液的血凝價是1:2？?？滋?/p>

1稀釋倍數(shù)

1:212

3

4

5

6

7

8

9

10

RBC1:22

1:23

1:24

1:25

1:26

1:27

1:28

1:291:210生理鹽水

5050505050

5050505050

50病毒懸液

50/1%紅細胞

5050

50

50

50

50

50

50

50

5050

50

50

50

50

50

50

50

50

50棄50μl血凝試驗（HA）震蕩后置37℃25~30min觀察結(jié)果。Agglutination

patterns

observed

with

HAI

plate

tilted

at

a60°

angle.Diana

L.

Noah

et

al.

Clin.

Vaccine

Immunol.

2009;16:558-566（二）血凝抑制試驗（HI）1~11孔加入25μl生理鹽水;第1孔加待檢血清25μl，倍比稀釋至第10孔;1~11孔加25μl

4個血凝單位的病毒懸液;1~12孔中每孔加入1%的紅細胞50μl;震蕩后置37℃25~30min觀察結(jié)果;紅細胞凝集100%的抑制作為結(jié)果判定的終點。如果血凝價為1:28

（256個單位），那么4個血凝單位就是將病毒液進行26倍（64倍）稀釋10/640=

1/26,所以病毒原液取10μl，生理鹽水取630μl；4個血凝單位病毒懸液體積：25μl/孔×12孔=400μl?？滋?/p>

1

2

3

4

5

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7

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10

Virus

血清稀釋倍數(shù)

1:21

1:22

1:23

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1:26

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1:28

1:29

1:210生理鹽水25

25

25

25

25

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25

25

25

2525

25被檢血清25

25

25

25

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25

25

25

25

25/病毒懸液25

25

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25

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25

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25

251%RBC50

50

50

50

50

50

50

50

50

502525

/50

50棄25μl血凝抑制試驗（HI）震蕩后置37℃25~30min觀察結(jié)果。血凝抑制試驗結(jié)果判定血清對照孔：RBC沉于孔底，無自凝病毒對照孔：凝集RBC對照孔：無自凝