第五章滅菌和菌種保藏

第五章滅菌和菌種保藏第1頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月污染雜菌的危害

1.消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2.分泌抑制發(fā)酵生長(zhǎng)的有害物質(zhì)。3.分泌嚴(yán)重改變培養(yǎng)液性質(zhì)的物質(zhì)。4.分泌抑制產(chǎn)物生物合成的有毒副作用的物質(zhì)。5.產(chǎn)生破壞代謝產(chǎn)物的酶類。輕者影響產(chǎn)量，重者導(dǎo)致全軍覆沒

要認(rèn)真做好培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備、管道與附件的滅菌、空氣除菌、嚴(yán)格控制生產(chǎn)操作第五章滅菌第2頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)滅菌的基本原理滅菌：是指用化學(xué)的或物理學(xué)的方法殺滅或除掉物料或設(shè)備中所有的有生命的有機(jī)體的技術(shù)或工藝過(guò)程。工業(yè)中常用的滅菌方法：化學(xué)物質(zhì)滅菌、熱滅菌（包括干熱滅菌和濕熱滅菌）、輻射滅菌和過(guò)濾介質(zhì)除菌。第五章滅菌第3頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)滅菌的基本原理一、幾種常用滅菌方法的基本原理

(一)化學(xué)物質(zhì)滅菌甲醛、苯酚、高錳酸鉀、潔爾滅、氯化汞、表面活性劑等與微生物細(xì)胞中某種化學(xué)成分反應(yīng)，如使蛋白質(zhì)變性、酶類失活、破壞細(xì)胞膜通透性等。

生產(chǎn)中使用的培養(yǎng)基里含有蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)亦易于與上述化學(xué)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)藥物加入培養(yǎng)基之后很難除掉。

所以不能用于培養(yǎng)基的滅菌，只能用于空間、設(shè)備、和器械的消毒滅菌。第五章滅菌第4頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)滅菌的基本原理一、幾種常用滅菌方法的基本原理(二)輻射滅菌是利用高能量的電磁輻射和微粒輻射來(lái)殺滅微生物。紫外線：有效波長(zhǎng)2400-3000?，對(duì)微生物有高度致死效應(yīng)，主要是與菌體核酸的光化學(xué)反應(yīng)而造成菌體死亡。對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和芽孢均有效。但穿透力低，只適于表面滅菌。第五章滅菌X射線和γ射線:使菌體內(nèi)的水和有機(jī)物產(chǎn)生強(qiáng)烈的離子化反應(yīng)，阻礙微生物代謝活動(dòng)而導(dǎo)致菌體迅速死亡。雖然滅菌效果好，但穿透力強(qiáng)，不安全不經(jīng)濟(jì)。第5頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)滅菌的基本原理一、幾種常用滅菌方法的基本原理

(三)干熱滅菌

指在干燥高溫條件下，微生物細(xì)胞內(nèi)的各種與溫度有關(guān)的氧化反應(yīng)速度迅速增加，使微生物的致死率迅速增高的過(guò)程。一般160℃，1小時(shí)。主要用于需要保持干燥的器械、容器的滅菌。第五章滅菌第6頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)滅菌的基本原理一、幾種常用滅菌方法的基本原理

(四)濕熱滅菌是直接蒸汽滅菌，蒸汽冷凝時(shí)釋放大量潛熱，并具有強(qiáng)大的穿透力，在高溫和水存在時(shí)，微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)極易發(fā)生不可逆的凝固性變性，短時(shí)間內(nèi)殺死微生物。經(jīng)濟(jì)快速，被廣泛應(yīng)用與工業(yè)生產(chǎn)。第五章滅菌第7頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)滅菌的基本原理二、濕熱滅菌的原理

大多數(shù)微生物最適溫度為25~27℃,維持生命活動(dòng)的溫度為5~50℃，當(dāng)溫度超過(guò)最高限溫時(shí)微生物就會(huì)發(fā)生死亡。致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時(shí)間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需要的時(shí)間。微生物的營(yíng)養(yǎng)體、芽孢和孢子的結(jié)構(gòu)不同，對(duì)熱的抵抗力也不同。

無(wú)芽孢菌在60℃保溫10min即可全部被殺死。

芽孢要在100℃下保溫10min到幾小時(shí)才能被殺死。

嗜熱細(xì)菌在120℃下仍可耐受20~30min。第五章滅菌第8頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)滅菌的基本原理熱阻：指微生物在某一種特定條件下（主要是溫度和加熱方式）的致死時(shí)間。一般所指的滅菌是否徹底，是以能否殺死熱阻大的芽孢桿菌為指標(biāo)。第五章滅菌第9頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月對(duì)數(shù)殘留定律：微生物在滅菌過(guò)程中，是隨時(shí)間逐漸死亡的，其減少速率(dN/dt)與一瞬間殘留的菌數(shù)成正比。第五章滅菌第一節(jié)滅菌的基本原理實(shí)際設(shè)計(jì)時(shí)常用Nt＝0.001即1000批次的滅菌中只有一批失敗。相同條件下，不同微生物的K值是不同的，K值越小，熱阻越大。第10頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、培養(yǎng)基的滅菌溫度選擇用濕熱滅菌方法對(duì)培養(yǎng)基滅菌時(shí)，加熱的溫度和時(shí)間對(duì)微生物死亡和營(yíng)養(yǎng)成分均有破壞作用，因而選擇一種既能達(dá)到滅菌要求又能減少營(yíng)養(yǎng)成分被破壞的溫度和受熱時(shí)間，是研究培養(yǎng)基滅菌質(zhì)量的重要內(nèi)容。絕大多數(shù)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分的破壞和菌體死亡都屬于一級(jí)分解反應(yīng)。ArrheniusEquation:第五章滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌微生物營(yíng)養(yǎng)成分反應(yīng)速度常數(shù)增加的倍數(shù)第11頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、培養(yǎng)基的滅菌溫度選擇隨溫度的升高，滅菌反應(yīng)速度常數(shù)增加的倍數(shù)大于營(yíng)養(yǎng)成分破壞反應(yīng)速度常數(shù)增加的倍數(shù)。

Q10：溫度升高10℃時(shí)的反應(yīng)速度常數(shù)與原溫度時(shí)的反應(yīng)速度常數(shù)的比值。一般的化學(xué)反應(yīng)Q10為：1.5~2.1殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體的反應(yīng)Q10為：5~10殺死芽孢時(shí)的反應(yīng)Q10為：35第五章滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌微生物營(yíng)養(yǎng)成分

芽孢VB2118℃,15min99.99%10%120℃,1.5min99.99%5%采用高溫快速滅菌方法，即可達(dá)到殺死培養(yǎng)基中的全部微生物的目的，又可減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞第12頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、培養(yǎng)基的滅菌方法分批滅菌和連續(xù)滅菌（一）分批滅菌（實(shí)罐滅菌）

是將配置好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，用直接蒸汽加熱，達(dá)到滅菌要求的溫度和壓力后維持一定時(shí)間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度。這種方法不需要其他的附屬設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，是國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)中常用的方法。但加熱和冷卻時(shí)間較長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)成分有一定的損失，罐利用率低，不能采用高溫快速滅菌工藝。第五章滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌第13頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、培養(yǎng)基的滅菌方法分批滅菌和連續(xù)滅菌（一）分批滅菌第五章滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌t1t2t3加熱維持冷卻如果知道t1和t3，合理設(shè)計(jì)維持時(shí)間t2，也能減少滅菌過(guò)程中培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的破壞。發(fā)酵罐容積越大，加熱和冷卻的時(shí)間越長(zhǎng)，這兩段時(shí)間實(shí)際上也有一定的滅菌作用。第14頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、培養(yǎng)基的滅菌方法分批滅菌和連續(xù)滅菌（一）分批滅菌

1.加熱和冷卻時(shí)間的工藝計(jì)算第五章滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌第15頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、培養(yǎng)基的滅菌方法分批滅菌和連續(xù)滅菌（一）分批滅菌

1.加熱和冷卻時(shí)間的工藝計(jì)算第五章滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌第16頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、培養(yǎng)基的滅菌方法

Del因素：滅菌程度的對(duì)數(shù)值，用U表示。（一）分批滅菌

2.維持時(shí)間t2的工藝計(jì)算第五章滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌Del因素第17頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、培養(yǎng)基的滅菌方法（二）連續(xù)滅菌培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過(guò)一套滅菌設(shè)備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐的工藝過(guò)程。特點(diǎn)：

1.迅速，損失少。

2.發(fā)酵罐非生產(chǎn)占用時(shí)間少，容積利用率高。

3.自動(dòng)化，熱能利用率合理。

4.不適用于粘度大和固形物含量高的培養(yǎng)基。

5.增加設(shè)備、操作環(huán)節(jié)、染菌機(jī)率。第五章滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌第18頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、培養(yǎng)基的滅菌方法（二）連續(xù)滅菌

1.由熱交換器組成的連續(xù)滅菌系統(tǒng)第五章滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌新鮮培養(yǎng)基第一個(gè)熱交換器20~30s,90~120℃第二個(gè)熱交換器140℃,30~120s第三個(gè)熱交換器20~30s含淀粉培養(yǎng)基須用酸或酶水解后再用連續(xù)滅菌，否則黏度太大，影響滅菌1mm懸浮顆粒須增加1s，1cm須增加100s，所以培養(yǎng)基中顆粒＜2mm發(fā)酵罐第19頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、培養(yǎng)基的滅菌方法（二）連續(xù)滅菌

2.蒸汽直接加熱培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌系統(tǒng)第五章滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌新鮮培養(yǎng)基直接蒸汽加熱140℃熱交換器回收熱能由于冷凝，培養(yǎng)基被稀釋，滅菌溫度和壓力的控制受影響。發(fā)酵罐第20頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、培養(yǎng)基的滅菌方法（二）連續(xù)滅菌

3.由連消塔、維持罐和冷卻器組成的連續(xù)滅菌系統(tǒng)第五章滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌第21頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第五章滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌三、發(fā)酵設(shè)備的滅菌第22頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、空氣除菌的方法城市上空空氣中含有的細(xì)菌數(shù)為3000-10000個(gè)/m2，因此在空氣引進(jìn)發(fā)酵罐之前必須進(jìn)行嚴(yán)格處理，除去其中含有的微生物和其他有害成分。

酵母培養(yǎng)過(guò)程中耗氧量大，無(wú)菌程度要求不十分嚴(yán)格，可采用高壓離心式鼓風(fēng)機(jī)通風(fēng)即可。

抗生素等多數(shù)品種發(fā)酵，耗氧量大，無(wú)菌程度要求十分嚴(yán)格，所以空氣必須先經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的無(wú)菌處理后才能通入發(fā)酵罐內(nèi)

加熱滅菌：可用蒸汽、電能、空氣壓縮過(guò)程中產(chǎn)生的熱量進(jìn)行滅菌?？諝鈮嚎s對(duì)無(wú)菌程度要求不高的發(fā)酵過(guò)程是可行的。

介質(zhì)過(guò)濾除菌：把空氣中的各種微粒和極少量的游離微生物捕集起來(lái)予以除掉。

靜電除菌

化學(xué)滅菌等第五章滅菌第三節(jié)空氣除菌第23頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、無(wú)菌檢查（一）無(wú)菌試驗(yàn)

1.肉湯培養(yǎng)法2.斜面培養(yǎng)法3.雙碟培養(yǎng)法（二）染菌的判斷

1.連續(xù)3個(gè)時(shí)間的酚紅肉湯無(wú)菌樣發(fā)生顏色變化或渾濁。

2.雙碟上連續(xù)3個(gè)時(shí)間樣品長(zhǎng)出雜菌

3.檢查樣品保留，以備長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。一般12小時(shí)后。第五章滅菌第四節(jié)無(wú)菌檢查與染菌處理第24頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、染菌的處理（一）污染雜菌的處理

1.種子罐的處理

2.發(fā)酵罐的處理

3.染菌后設(shè)備的處理（二）污染噬箘體的處理噬菌體污染后發(fā)酵液轉(zhuǎn)稀，泡沫增多，早期鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體染色不均勻，在較短時(shí)間內(nèi)菌體大量自溶，最后僅殘留菌絲片段，平皿中出現(xiàn)典型的噬菌斑，營(yíng)養(yǎng)成分很少消耗，產(chǎn)物合成停止。

處理方法：發(fā)酵液用高壓蒸汽滅菌后放掉，嚴(yán)防發(fā)酵液任意流失；全部停產(chǎn)，對(duì)環(huán)境進(jìn)行全面的清洗和消毒，斷絕噬菌體的寄生基礎(chǔ)；更換生產(chǎn)菌種，篩選抗噬菌體的菌種，防止重復(fù)污染。第五章滅菌第四節(jié)無(wú)菌檢查與染菌處理第25頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第六章菌種保藏第26頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件1、

經(jīng)長(zhǎng)期保藏后菌種存活健在；2、

保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。3、菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。第27頁(yè)，課件共29頁(yè)，創(chuàng)作于20