第八章鉬酶及含鉬蛋白固氮酶

第八章鉬酶及含鉬蛋白固氮酶第1頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)概述在生物體中，鉬是唯一的第二過渡元素。鉬酶的相對分子量較大，純化困難，且鉬易于發(fā)生價態(tài)變化，鉬的價態(tài)多，存在的狀態(tài)復雜，因此關于鉬酶的許多問題仍未弄清楚。鉬是人體生長必需的微量元素。在機體內(nèi)的分布很廣，在所有器官、組織和體液中均能檢出。鉬是多種酶的輔助因子；鉬參與酶類和蛋白質(zhì)合成，參與維生素B12組成及代謝，促進紅細胞發(fā)育和成熟，防止貧血，促進核酸和蛋白質(zhì)合成等很多生理過程。鉬缺乏：鉬缺乏時會誘發(fā)心肌病或其它心血管病。缺鉬，還可誘發(fā)食道癌、骨癌、肝癌以及齲齒。孕婦缺鉬可引起胎兒發(fā)育障礙。

鉬過量：過量的鉬可誘發(fā)痛風和癌癥。第2頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月某些含鉬的食物食物來源不同,其鉬的含量差異較大。一般而言,植物性食物以豆類及其制品含量最豐富。動物性食物以海產(chǎn)品中含量最高,其次是動物的肝臟和腎臟。鉬主要通過在食物鏈中的遷移進入人體內(nèi)。第3頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月鉬在人體內(nèi)主要分布鉬(molybdenum)廣泛存在于水、土壤以及各種動植物體內(nèi)。鉬在人體內(nèi)主要分布在肝臟和腎臟。人體血液中鉬的含量能較好地反映出體內(nèi)鉬的攝入情況。中國營養(yǎng)學會2000年制定的中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量規(guī)定，成人鉬的推薦攝入量是60微克/天，可耐受最高攝入量350微克/天。第4頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月

一些鉬酶的主要成分鉬酶來源相對分子質(zhì)量鐵鉬含量/分子其他組分MoFe黃嘌呤氧化酶牛乳275000282FAD黃嘌呤脫氫酶雞肝300000282FAD醛氧化酶兔肝300000282FAD硝酸鹽還原酶粗糙脈孢菌2300001～FAD,cyt.b亞硫酸氧化酶小牛肝110000244cyt.b固氮酶棕色固氮菌270000232Cys第5頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月所有與鉬有關的金屬蛋白和金屬酶均與氧化還原有關，并參與生物體內(nèi)的電子傳遞。鉬酶的組成比較復雜，某些鉬酶如固氮酶，黃嘌呤氧化酶，黃嘌呤脫氫酶除了含鉬輔酶外，還含有鐵硫蛋白或黃素腺嘌呤二核苷酸；另一些鉬酶如硝酸鹽還原酶，亞硫酸鹽氧化酶還含有細胞色素。鉬酶中的鐵硫蛋白或細胞色素一般充當電子傳遞媒介，鉬活性中心則起著底物結(jié)合對底物進行氧化還原等生物催化作用。鉬酶可按其結(jié)構和功能的差異分為固氮酶和轉(zhuǎn)氧酶。第6頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月RepresentativeMolybdoenzymesEnzyme

ReactionNitrogenasea

N2+6H++6e-→2NH3Nitratereductase

NO3-+2e-+2H+→NO2-+H2OSulfite

SO32-+H2O→SO42-+2H++2e-Xanthineoxidasea

NitrogenasecontainsaFeMo-ClustercotactorAllotherenzymescontainMo-pterrn第7頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月鉬輔基：蝶呤輔酶鉬轉(zhuǎn)氧酶分為氧化酶和還原酶。氧化酶為加氧過程；還原酶為失氧過程：黃嘌呤+O→尿酸

NO3-→

O+NO2-（MoIV→MoVI）SO32-+O→SO42-(MoVI→MoIV)

CO2→O+CORCHO+O→RCOOH

鉬轉(zhuǎn)氧酶的催化反應與電子傳遞和鉬價態(tài)有關。第8頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)固氮酶(Nitrogenase)常溫常壓下高效地把N2轉(zhuǎn)化為NH3；19世紀80年代，HellriegelandWilfarth首先發(fā)現(xiàn)并證實自然界中生物固氮的存在，之后人們發(fā)現(xiàn)生物固氮廣泛發(fā)生于微生物和原核生物中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少200種微生物具有生物固氮功能。目前世界每年消耗近1億噸尿素用于農(nóng)業(yè)，生物固氮提供了全球所需氮肥量的75%（3億噸尿素）。第9頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月工業(yè)生產(chǎn)尿素需要高溫高壓消耗大量的能源，同時污染大氣，造成對環(huán)境的第一次污染；同時所用化肥僅有30%被農(nóng)作物利用，大部分進入地下水，對環(huán)境造成第二次污染。固氮微生物在常溫常壓下利用可再生能源固定空氣中的氮素，并直接被植物吸收利用，對環(huán)境不產(chǎn)生任何污染。早日實現(xiàn)人工生物固氮是當前生物無機化學及相關學科發(fā)展的一個重要目標?。?！第10頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月人類對生物固氮的認識直到20世紀60年代采取得了突破性的進展。①第一次從細胞水平上觀察到在ATP存在下的生物固氮現(xiàn)象。這極大的刺激了固氮酶的生物化學研究和發(fā)展；②隨后活性酶從生物體內(nèi)被分離提純出來，人們利用各種物理方法對固氮酶進行更深入地研究；③同時，科學家開展了在過渡金屬配合物存在下，氮氣在溶液中的化學反應，第一個過渡金屬雙氮配合物被合成出來，且出乎意料的穩(wěn)定；其后，許多分子氮配合物被相繼合成出來，并研究它們在溶液中的還原反應（質(zhì)子化后可形成肼和氨）?！?1頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月固氮酶的分離提純，在溶液中氮分子的還原以及過渡金屬雙氮配合物的的制備三方面是相互關聯(lián)又相互促進的。在相當長的一段時間里，固氮酶的結(jié)構和生物固氮機理一直是科學家們努力探求的目標。20世紀70年代，成功分離出固氮酶活性中心鐵鉬輔基，測定了構成固氮酶的鐵蛋白和鉬鐵蛋白的單晶結(jié)構，到目前（1993年）為止已經(jīng)測定了1.16?高分辨率的鉬鐵固氮酶的晶體結(jié)構。在人工固氮酶的研究上取得了重大進展。第12頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月固氮酶催化下列反應第13頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月生物固氮體系可以分為自生和共生固氮兩種類型；部分固氮微生物只有在有氧的環(huán)境中才能有固氮功能；另外一種固氮微生物在缺氧的條件下能夠固氮；此外還有一些固氮微生物在需氧和厭氧的條件下均可以自由固氮；根據(jù)固氮酶所含金屬的種類，固氮酶主要分為三類：鉬固氮酶，釩固氮酶和鐵固氮酶每類固氮酶均有兩種金屬蛋白組成，除鐵蛋白外，還含有另一種鉬鐵蛋白（MoFe）或釩鐵蛋白（VFe）或鐵鐵蛋白（FeFe）。大豆根瘤菌第15頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月

1993年，Rees等得到了分辨率為0.22nm的葡萄球固氮菌和巴氏芽孢菌固氮酶鉬鐵蛋白的射線結(jié)構數(shù)據(jù)，基本上確定了固氮酶的結(jié)構。它是由鐵蛋白和鉬鐵蛋白兩種相對獨立，相互分離的純蛋白組成。鐵蛋白是一種依賴于供給能量的電子傳遞體，具有把電子傳遞給鉬鐵蛋白的功能；鉬鐵蛋白是結(jié)合底物分子和催化底物還原的部位。

固氮酶的組成第16頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月鉬固氮酶的結(jié)構第17頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月鐵蛋白是個α2二聚體，含有一個[Fe4S4]2+/1+原子簇橋聯(lián)兩個亞基。MoFe蛋白（Mo-FeProtein,α2β2四聚體）的每一個αβ對含有一對[Fe4S4](即P原子簇)和一個FeMo輔因子(M原子簇)；

第18頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月鉬鐵蛋白的晶體結(jié)構第19頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月鉬固氮酶的結(jié)構及電子傳遞第20頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月鉬固氮酶中鐵蛋白的結(jié)構

各種不同類型的微生物固氮菌的鐵蛋白均已經(jīng)分離、純化，并進行了非常透徹的研究，他們的大小和功能大同小異。他們均是由兩個相同的亞基形成的二聚體，分子量約60000Da,兩個亞基之間通過四個半胱氨酸上的硫原子橋聯(lián)著一個Fe4S4原子簇結(jié)構。Fe4S4原子簇單元位于蛋白球的表面，易于接近溶劑分子，因而鐵蛋白對氧化極度敏感。主要功能：1.電子傳遞媒介的作用；[Fe4S4]2+，[Fe4S4]+2.它的存在是生物合成FeMo輔酶所必需的；3.它的存在對FeMo輔酶插入改性的缺FeMo輔酶的鉬鐵蛋白是必要的。第21頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月P-cluster：電子從鐵蛋白金屬簇中心傳遞到FeMo-輔酶中心的橋梁作用。還原態(tài)氧化態(tài)第22頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月

由于M-簇是固氮酶固氮成氮的活性中心所在，對它的研究早已引起許多化學家的重視。對比，自1973年以來國內(nèi)外學者根據(jù)結(jié)構化學、化學鍵理論、絡合催化原理和化學探針等方法就提出的固氮酶網(wǎng)兜模型，駢聯(lián)活口雙立方烷模型等十幾種原子簇模型，都是以Mo為結(jié)合底物的核心原子，自然界里為了有效地固氮成氮而演進出的這種獨特的活性中心結(jié)構，顯得比人們的智慧推想更為周到。根據(jù)這新的信息，對固氮酶活性中心的結(jié)構與功能的研究將會有新的突破。M-簇的重要性第23頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月FeMo-輔酶與蛋白結(jié)合部位不多，相對松弛，故易提??；MoFe-Co（M簇）第24頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月

M簇中相鄰的Fe-Fe間的距離為2.58-2.67?；Mo-Fe的距離為2.67-2.73?,這意味著Fe-Fe和Mo-Fe之間存在著一定程度的金屬-金屬鍵合作用。MoFe-Co（M簇）第25頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月電子傳遞機制？鐵蛋白的循環(huán)？鉬鐵蛋白的催化循環(huán)？氫化酶何以體現(xiàn)？催化過程中，氮氣與鐵結(jié)合還是與鉬結(jié)合？ATP何處提供？有無特異性？……小方程，大學問?。。〉?6頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月1.電子傳遞機制

鐵蛋白與FeMo輔酶間的距離為32?，因此他們之間直接進行電子傳遞是不可能的。第27頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月2.固氮酶中鐵蛋白循環(huán)圖第28頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月3.固氮酶中鉬鐵蛋白循環(huán)圖第30頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月4.固氮酶與底物結(jié)合的可能部位與鉬結(jié)合

底物與鉬鐵蛋白輔基的結(jié)合位置和方式仍然是懸而未決的問題，有待人們進一步深入研究。第31頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月可能與鐵結(jié)合的部位第32頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月釩固氮酶VanadiumNitrogenase

釩固氮酶在無氧條件下才有催化活性。釩固氮酶在還原N2

的過程中利用其50%的自身還原等價物產(chǎn)生H2

，而鉬固氮酶僅利用25%。因此，釩固氮酶的催化活性不如鉬固氮酶，只有在土壤中鉬缺乏的條件下，生物才會采用釩固氮系統(tǒng)。但釩固氮酶具有鉬固氮酶不及的優(yōu)點:(1)低溫(如5℃時)和酸性環(huán)境下釩固氮酶比鉬固氮酶還原效率高;(2)釩固氮酶除將乙炔還原為乙烯外，還部分還原為乙烷;(3)釩固氮酶具有明顯的氫化酶活性;(4)釩固氮酶可在N2還原過程中產(chǎn)生少量中間體肼。化學通報，2007,4,270

第33頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月

第三節(jié)雙氮過渡金屬配合物

1965年，A.D.Allen在常溫常壓下合成了第一個雙氮過渡金屬配合物[Ru(NH3)5(N2)]Cl2，改變了氮分子不活潑的觀念，提供了活化分子氮的途徑。通過研究雙氮配合物獲得生物固氮信息的希望激勵科學家深入探索更多的例證。目前已經(jīng)合成數(shù)百種雙氮配合物。這一研究成果開辟了一個新的研究領域，推動人們探索生物固氮的秘密。1．氮分子的不活潑性

最高占有軌道3σg的能量較低，-15.6eV，而最底空軌道3σg的能量較高，-7.0eV。即將電子從N2完全轉(zhuǎn)移到受體或從電子供體完全轉(zhuǎn)移到N2都很困難。因此N2即不容易氧化也難以還原。N2分子通過什么途徑活化是化學模擬生物固氮研究的重大課題。

第34頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月氮分子軌道能級與電子云分布

第35頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月2．雙氮配合物的成鍵方式：端基配位和側(cè)基配位[CoH(N2)(PPh3)3]的結(jié)構[{(NH3)5Ru}2(N2)]4+的結(jié)構第36頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第37頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月[{C6H5Li}6Ni2N2(Et2O)2]2]]的結(jié)構（略去了苯基和醚）第38頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月3.氮分子配位活化

在端基配位的雙氮過渡金屬配合物中，氮原子經(jīng)過適當?shù)摩?分子軌道與金屬d軌道重疊，按照N2?金屬σ成鍵及金屬?N2π成鍵方式，從末端與金屬結(jié)合。側(cè)基配位的σ鍵形成降低了兩個氮原子之間的電子云密度，反饋π鍵更削弱了兩個氮原子的結(jié)合強度，這兩種作用都促使N2活化，其中又以反饋π鍵為主。

端基配位與側(cè)基配位的雙氮過渡金屬配合物的成鍵方式

第39頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月中心金屬原子具有低氧化態(tài)，電子構型多為d5-d10。共配體的Lewise堿越強，越有利于形成反饋π鍵，N2活性越大。與端基配位相比，側(cè)基配位雙氮配合物的雙鍵更長，N2活性越大。

配合物雙氮鍵長νN≡N/cm-1N2109.82331[Ru(NH3)5(N2)]2+1122114[Os(NH3)5(N2)]2+1122208[Os(NH3)4(CO)N2]2+

2108[Mo(N2)2(diphos)2]1102040[{(NH3)5Ru}2(N2)]4+1122100MoCl4{N2ReCl(PR3)4}21281800[{(C6H5Li)6Ni2N2(Et2O)2}2]135

第40頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月4．配位氮原子的反應活性

合成雙氮配合物只是研究的第一步。如何使已經(jīng)初步活化的雙氮還原并質(zhì)子化生成氨，這個難度很大的課題迄今進展緩慢!!!第41頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第43頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第45頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第46頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第48頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第49頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第50頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第51頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)固氮酶的模擬

近幾十年來，化學模擬生物固氮的研究一直是一個熱點。我國科學家在此領域做了大量非常出色的研究工作，例如，早在70年代，盧嘉錫和蔡啟瑞等人就參與了FeMoco的結(jié)構的研究，分別提出了福州模型和廈門模型，引起了國際重視。90年代初期，美國學者Rees等人闡明了固氮酶的活性中心原子簇及其周圍多肽分子的三維結(jié)構后，從而使化學模擬生物固氮的研究出現(xiàn)了一個新的高潮。近年來，國內(nèi)外的理論化學工作者，依據(jù)Rees的FeMoco中心絡合模型，提出了他們各自不同的有關N2的鍵合模型。雖然，國內(nèi)外對化學模生物固氮的研究進展顯著，但仍然主要處于理論研究階段。第52頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月鐵鉬輔基模型化合物的研究

20世紀70年代固氮酶的結(jié)構仍未確定，化學家基于EXAFS以及其他譜學與化學分析研究提出了Fe-Mo輔基模型化合物的結(jié)構類型。Hodgson根據(jù)EXAFS數(shù)據(jù),提出兩種結(jié)構模型：(a)(b)第53頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月福州模型雙網(wǎng)兜狀

第54頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月廈門模型并聯(lián)雙座雙立方烷第55頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月

時至今日，圍繞著固氮酶的化學模擬這個總體目標，各國科學家合成了數(shù)以百計的具有立方烷或類似立方烷結(jié)構的Fe-S和Mo-Fe-S簇合物。第56頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月FeMo-輔酶金屬簇的結(jié)構模擬第57頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月ProfessorRichardH.Holm

P-cluster的結(jié)構模擬Prof.KazuyukiTatsumi

第58頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)鉬轉(zhuǎn)氧酶及其模擬除固氮酶外，另外一種非常重要的鉬酶為轉(zhuǎn)氧酶，已知的轉(zhuǎn)氧酶包括：黃嘌呤氧化酶和脫氫酶、硝酸還原酶、亞硫酸氧化酶、醛氧化酶、二甲亞砜還原酶等，雖然它們的結(jié)構和功能各異，但都含有相同的鉬輔基-蝶呤輔酶。第59頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月

黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase)

它與黃嘌呤脫氫酶是同一種酶中的不同存在形式。核酸在各種動植物中分解，降解產(chǎn)物腺嘌呤和鳥嘌呤經(jīng)某些酶的作用后轉(zhuǎn)化為黃嘌呤。生成的黃嘌呤由黃嘌呤氧化酶催化氧化為尿酸而排出體外，生成的H2O2被catalase分解為O2和H2O。反應的意義在于，核酸分解所形成的氮堿隨血液到達肝臟，經(jīng)特定的酶作用后脫氨基化得嘌呤等物質(zhì)，在這種酶的作用下氧化為尿酸。別嘌呤醇第60頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月黃嘌呤氧化酶活性部位第61頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第62頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月NitrateReductase:它廣泛分布在植物和微生物中，是NO3-

還原為NO2-的催化劑。這種酶的生理功能取決于有機體，通常亞硝酸還原酶催化NO2-還原為NH3，因此，硝酸酶承擔NO3-轉(zhuǎn)化為NH3的第一步。硝酸鹽還原為亞硝酸鹽是一個能量釋放過程，因而是厭氧微生物獲取能量的過程。第63頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第64頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月第65頁，課件共69頁，創(chuàng)作于2023年2月NitratecandisplaceligandX(H2O?)andbindtoreducedMo(IV).Two-electronreductivecleavageofaN-Obondprod