第三章第一節(jié)第二節(jié)生物化學(xué)檢驗常用技術(shù)

第三章第一節(jié)第二節(jié)生物化學(xué)檢驗常用技術(shù)第1頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)光譜分析技術(shù)吸收光譜分析技術(shù)發(fā)射光譜分析技術(shù)散射光譜分析技術(shù)第2頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月一、吸收光譜分析法第3頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月4微粒性(E=hv)

波粒二象性波動性(=c/v)E=hv=hc/

E=hv是電子能量公式，其中h是普朗克常量，v是電子頻率，普朗克常數(shù)記為h，是一個物理常數(shù)，用以描述量子大小。普朗克常數(shù)的值約為：6.626196×10^-34J·s光的能量與光的波長成反比，與光的頻率成正比光是高速傳播的電磁波第4頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月5海水為什么是藍色的？第5頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月6熒光棒為什么會發(fā)光？第6頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月7能量轉(zhuǎn)移

理：當(dāng)光輻射通過某種物質(zhì)時，組成該物質(zhì)的分子（原子）與光子發(fā)生“碰撞”，光子的能量因此轉(zhuǎn)移至分子（原子）上，使它們由基態(tài)(低能態(tài))躍遷到激發(fā)態(tài)(高能態(tài))，這種躍遷稱為激發(fā)。第7頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月8能量釋放

處于較高能態(tài)的分子(激發(fā)態(tài)分子)不穩(wěn)定，當(dāng)其返回基態(tài)時，以熱或發(fā)射光譜的形式將能量釋放出來。所發(fā)射出的相應(yīng)光譜，稱分子發(fā)射光譜。第8頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月9E1E0吸收光譜發(fā)射光譜激發(fā)態(tài)基態(tài)E1＞E0第9頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月10(二)、光吸收定律1、吸光度與透光度

A=-lgT=-lgIt/I0=lgI0/It

當(dāng)光線通過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透過溶液。設(shè)入射光強度為I0，透射光強度為I，I和I0之比稱為透光度，即：T=It/I0T常用百分?jǐn)?shù)表示，稱為百分透光率。透光度的負(fù)對數(shù)稱為吸光度即：入射光I0透射光It第10頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月112、Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關(guān)系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)。A=KLCA為吸光度；K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L為溶液層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度Lambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體當(dāng)一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時，吸光度與溶液層厚度和溶液濃度成正比。L第11頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第12頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月A=KLC第13頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)ε：其意義是1摩爾濃度的溶液，在光徑1cm時對某波長光束的吸光度。當(dāng)溶液層厚度單位為cm，濃度單位為mol/L時，K即成為摩爾吸光系數(shù)。NADH在260nm時，ε260nm=15000，NADH在340nm時，ε340nm=6220。14NADHNADH第14頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月Lambert-Beer定律適用于:可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體以及分散均勻的固態(tài)或氣態(tài)樣品.單色光均勻介質(zhì)吸收物質(zhì)無相互作用3、Lambert-Beer定律的應(yīng)用條件4、Lambert-Beer定律的偏離現(xiàn)象溶液：稀溶液、化學(xué)變化光學(xué);非單色光、散射和折射儀器;光源、實驗條件第15頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月5、Lambert-Beer定律的應(yīng)用

第16頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月170.575光源單色器吸收池檢測器顯示器鎢燈、鹵鎢燈350～1000氫燈、氘燈180～360濾光片棱鏡光柵玻璃比色皿石英比色皿（三）分光光度計的基本結(jié)構(gòu)第17頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月18光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源

在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在350～2500nm。紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。第18頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月192.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。包括濾光片、棱鏡和光柵等。①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。第19頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月203.比色杯

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測器利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.顯示器檢流計、數(shù)字顯示、微機進行儀器自動控制和結(jié)果處理第20頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月21儀器

可見分光光度計第21頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月22儀器

紫外-可見分光光度計第22頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月23Beckman紫外-可見分光光度計eppendorf紫外-可見分光光度計第23頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月24使用圖示 1.開啟電源，指示燈亮，儀器預(yù)熱10分鐘，選擇開關(guān)置于“T”。2.打開試樣室蓋（光門自動關(guān)閉），調(diào)節(jié)“0%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”。第24頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月253.將裝有溶液的比色皿放置比色架中。4.旋動波長手輪，把測試所需的波長調(diào)節(jié)至刻度線處。第25頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月265.蓋上樣品室蓋，將參比溶液比色皿置于光路，調(diào)節(jié)透過率“100%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0T”（如果顯示不到100%T，則可適當(dāng)增加靈敏度的檔數(shù)，同時應(yīng)重復(fù)“2”，調(diào)整儀器的“00.0”）。 第26頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月276.將參比溶液比色皿置于光路中，將選擇開關(guān)置于A，旋動吸光度調(diào)零旋鈕，使得數(shù)字顯示為.000，然后移入被測溶液，顯示值即為試樣的吸光度A值。第27頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月287．全部測定結(jié)束后，取出比色皿(洗凈)，關(guān)閉開關(guān).第28頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月29分光光度計的類型1.單光束

簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。2.雙光束自動記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價格較高。第29頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月303.雙波長

將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快束交替通過同一吸收池而后到達檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比池?！?1～2nm。兩波長同時掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。第30頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月31(1).標(biāo)準(zhǔn)曲線法

根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標(biāo)本處理方法作相同處理，在特定波長下測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，將對應(yīng)各點連成一條通過原點的直線，這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測溶液測定吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。方法：四、分光光度法在生化檢驗中的應(yīng)用第31頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月5.標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)置的濃度范圍足夠大。第32頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月332．比較法CR=(AR×Cs)/As己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時測定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計算出標(biāo)本的濃度，計算公式為：第33頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月火焰光度法是以火焰為能源使金屬元素激發(fā)后發(fā)射出特征譜線的特點進行檢測的分析方法。它是一種簡化的發(fā)射光譜分析法。五、火焰光度分析法FP640火焰光度計火焰光度法分析示意圖第34頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月火焰光度法的特點⑤應(yīng)用范圍窄③靈敏①快速②準(zhǔn)確④設(shè)備簡單試樣溶液于數(shù)分鐘內(nèi)可完成測定火焰光源穩(wěn)定性高，干擾少，誤差為2％~5％，可用于微量分析和常量分析分析堿金屬與堿土金屬，絕對靈敏度可達0．1～10×10－6g被測試樣易被火焰激發(fā)，產(chǎn)生的譜線較簡單，且均在可見光區(qū)，故使譜線分離和測量的設(shè)備簡單主要用于鉀、鈉離子定量分析第35頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月1.共存元素的干擾：共存元素、陰離子、陽離子的干擾2.火焰對測定的影響：火焰的純度和燃燒狀態(tài)的穩(wěn)定性3.標(biāo)準(zhǔn)品的影響：成分復(fù)雜，相互影響影響火焰光度分析的因素第36頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月六、散射光譜分析法透射比濁與散射比濁是免疫比濁的常見的兩種方法，其反應(yīng)的原理一樣，只是檢測的光信號與儀器的檢測器有區(qū)別。1、透射比濁操作簡便，適用于普通的自動生化分析儀和普通的分光光度計，幾乎所有的實驗室均能開展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測的周期較長。2、散射比濁的優(yōu)點是靈敏度、精密度均較高，檢測快速。其缺點是需特定的分析儀器，試劑價格高。光的散射用單色光照射透明溶液時，大部分按原來方向透射，而一小部分則按不同的角度散射開來。散射光譜分析法利用懸浮顆粒混濁液的散射光強度或?qū)θ肷涔鉁p弱的原理進行定量分析的方法。第37頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月38七、原子吸收分光光度法第38頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月39八、熒光光度法NanoDrop?ND-3300Fluorospectrometer

第39頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)40電化學(xué)分析方法基本原理離子選擇電極分類離子選擇電極的分析方法第40頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月電化學(xué)分析方法電化學(xué)分析是利用物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)，測定化學(xué)電池電位、電流或電量的變化進行分析的方法。41電位分析法：測定原電池電動勢以求物質(zhì)含量的分析方法電導(dǎo)法：通過電阻測定以求物質(zhì)含量的分析方法電容量分析法：借助某些物理量的突變作為分析重點的指示第41頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月一、電化學(xué)分析方法基本原理電位分析法是利用電極電位和濃度之間的關(guān)系來確定物質(zhì)含量的分析方法。42原電池是利用兩個電極之間金屬性的不同,產(chǎn)生電勢差,從而使電子的流動,產(chǎn)生電流.又稱非蓄電池，是電化電池的一種。第42頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月電極電位第43頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月電極電位測量在電位分析中，構(gòu)成電池的兩個電極，其中一個，其電位值隨待測離子濃(活)度的變化而變化，能指示待測離子的濃(活)度，稱為指示電極，或離子選擇性電極。指示電極而另一個電極，其電位不受試液組成變化的影響，具有較恒定的數(shù)值，只是作為測量電位的標(biāo)準(zhǔn)，稱為參比電極(參考電極)。

參比電極離子選擇性電極：電位法測定溶液中某種定離子活度的指示電極；能在多種離子存在的混合液中，選擇性地響應(yīng)該特定離子，指示出這種離子活度變化情況，測定離子的活度或濃度。第44頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月離子選擇性電極（ISE）45定義：離子選擇性電極是一種以電位法測定某些特定離子活度的指示電極。特點：電極的關(guān)鍵部件敏感膜對溶液中特定離子有選擇性響應(yīng)。敏感膜并不給出或得到電子，而是選擇性地讓某些離子滲透，同時包含離子交換過程測定原理：基于內(nèi)部溶液與外部溶液之間產(chǎn)生的電位差，即膜內(nèi)外被測離子活度的不同而產(chǎn)生電位差，稱之為膜電位。第45頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月

離子選擇性電極的類型和品種很多，外形也差異很大；但基本結(jié)構(gòu)都包括：對特定離子有選擇性響應(yīng)的薄膜(敏感膜或傳感膜)、內(nèi)參比溶液與內(nèi)參比電極。敏感膜將內(nèi)側(cè)參比溶液與外側(cè)的待測離子溶液分開，是電極的關(guān)鍵部位。ISE基本結(jié)構(gòu)內(nèi)參比電極電極殼體內(nèi)參比溶液敏感膜離子選擇性電極結(jié)構(gòu)示意圖第46頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月①選擇性好

在多數(shù)情況下，共存的離子干擾小，對組成復(fù)雜的試樣往往不需要分離處理就可直接測定。

②靈敏度高

電位法的檢出限為10-5～10-8mol/L，適于微量組分的測定，電位滴定法適于常量分析。

③快速

儀器設(shè)備簡單、操作方便、分析快速、測定范圍寬、不破壞試液，易于實現(xiàn)分析自動化。

④不破壞標(biāo)本對有色、渾濁標(biāo)本均可檢測。電位分析法的特點：第47頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月

根據(jù)國際純粹及應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)的建議，離子選擇性電極一般采用如下分類：

二、常用的離子選擇電極第48頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月玻璃膜電極二、常用的離子選擇性電極第49頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）玻璃電極及膜電位：玻璃電極是最早使用的離子選擇性電極。玻璃薄膜是決定電極性能的最重要組成部份。內(nèi)參比電極的電位是恒定的，與被測溶液的PH無關(guān)。玻璃電極用作測PH的指示電極，是因為跨越玻璃膜產(chǎn)生了膜電位。膜電位與待測溶液PH值有關(guān)。50第50頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）玻璃電極的優(yōu)點選擇性高：膜電位的產(chǎn)生不是電子的得失。其它離子不能進入敏感膜產(chǎn)生交換。當(dāng)溶液中Na+濃度比H+濃度高1015倍時，兩者才產(chǎn)生相同的電位；不受溶液中氧化劑、還原劑、顏色、沉淀及膠體、雜質(zhì)的影響，不易中毒；改變玻璃膜的組成，可制成對其它陽離子響應(yīng)的玻璃膜電極。51第51頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月氣敏電極如，二氧化碳?xì)饷綦姌O：微孔氣體滲透膜憎水但能透氣(由醋酸纖維、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成)。測定時，CO2氣體通過微孔滲透膜與中介溶液接觸(中介液是0.001mol/L的NaHCO3)；由于CO2與H2O結(jié)合生成碳酸，從而影響到碳酸氫鈉的電離平衡。氣敏電極通過界面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)進行工作的，離子電極用來指示中介液中某一離子活度的變化。溶解在水溶液中的氣體，只要能生成可用離子選擇性電極檢出的離子，均可用氣敏電極測定。用pH玻璃電極間接測定CO2的含量

氣敏電極是一種氣體傳感器，測定溶液中的氣體含量。原理：利用待測氣體對某一化學(xué)平衡的影響，使平衡中某特定離子的活度發(fā)生變化，來測定試液中被測氣體的分壓(含量)。

在氣敏電極的中介溶液中放入玻璃電極。測量時，控制試液的酸堿度，使CO2通過氣透膜擴散加入氣敏電極；引起中介溶液pH的改變。測定中介溶液的pH值，即可計算出試液中CO2的濃度。第52頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第53頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月

CO2+H2O===HCO3-+H+NH3+H2O===NH4++OH-SO2+H2O===HSO3-+H+2NO2+H2O===NO3-+NO2-+H+H2S+H2O===HS-+H3O+HCN+H2O===H3O++CN-HF+H2O===H3O++F-

凡是溶于水釋放H+的反應(yīng)，都可以用pH玻璃電極檢出；而后三種分別可以用S2-、CN-、F-等離子選擇性電極來檢測。可用電極測定的氣體第54頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的催化反應(yīng)專一強；酶電極有極高的選擇性。作為一種生物傳感器，酶電極特別適用于生物醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域。酶電極①選擇適合的指示電極②制成具有催化活性的水不溶性酶膜③把酶膜固定在電極的表面(酶的固定化)

酶電極的制作過程將生物酶涂布在離子選擇性電極或其它傳感器的敏感膜上，通過酶催化作用，使待測物質(zhì)產(chǎn)生能在該電極上響應(yīng)的離子或化合物，間接測定該物質(zhì)。脲酶催化分解尿素產(chǎn)生NH3、CO2，溶于水可得到不同產(chǎn)物NH3、CO2、NH4+、HCO3-等，可用相應(yīng)的離子選擇性電極來檢測它們，間接得到尿素的含量。常用的固定化技術(shù)有：吸附、試劑交聯(lián)、共價鍵合、包埋法(酶與載體聚丙酰胺混合后直接包在電極敏感部分形成酶凝膠層)。第55頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月幾種酶電極的品種與性能測定物質(zhì)酶檢測物測定范圍(mol/L)葡萄糖葡萄糖氧化酶O210-4～2*10-2尿素(脲)脲酶NH310-5～10-2膽固醇膽固醇氧化酶H2O210-5～10-2L－谷氨酸谷氨酸脫氫酶NH4+10-4～10-1L－賴氨酸賴氨酸脫羧酶CO210-4～10-1第56頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月

配制一系列已知活（濃）度的欲測離子的標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐一插入離子選擇性電極和參比電極，測出它們相應(yīng)的E值，以E對C作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。在同樣條件下測出未知溶液的E值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的欲測溶液的離子活（濃）度。57三、離子選擇電極的分析方法（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線法

第57頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月

當(dāng)待測溶液的成份比較復(fù)雜，離子強度比較大時，難以配制與待測溶液組成相近的標(biāo)液，此時，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法較適宜。58（二）標(biāo)準(zhǔn)加入法

第58頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）、儀器直讀法

該法是能在離子計上直接讀出被測離子的濃度，這種儀器稱為專用離子計。例如：PH計、氟離子計等。59第59頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月60（一）單一型電解質(zhì)分析儀電解質(zhì)分析法在臨床檢驗中的應(yīng)用

第60頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月61（二）組合型電解質(zhì)分析儀電解質(zhì)分析法在臨床檢驗中的應(yīng)用

第61頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月電解質(zhì)分析法在臨床檢驗中的應(yīng)用

62（三）全自動生化分析儀

第62頁，課件共72頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)電泳分析技術(shù)正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子帶電荷的