第二章基因操作的工具酶

第二章基因操作的工具酶第1頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月《基因工程原理》第一章導(dǎo)論第二章基因操作的工具酶第三章基因克隆的載體第四章基因克隆的策略第五章克隆基因的表達(dá)第六章基因工程的基本技術(shù)第2頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章基因操作的工具酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用第四節(jié)修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.

第3頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第4頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月50年代初發(fā)現(xiàn)了由寄主控制的限制和修飾現(xiàn)象(B)(K)大腸桿菌B大腸桿菌K114×10—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating第5頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月限制—修飾的酶學(xué)假說(shuō)(B)(B)酶切位點(diǎn)不被修飾噬菌體DNA被切割酶切位點(diǎn)被修飾Methylation基因組DNA不被切割1968年，Meselson和Yuan從大腸桿菌K和B中發(fā)現(xiàn)了I型限制性核酸內(nèi)切酶；1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離純化了第一個(gè)II型限制性核酸內(nèi)切酶HindII，使得DNA分子的體外精確切割成為可能。第6頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第7頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶的概念

限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonucleases）：是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并能精確特異地切割雙鏈DNA分子的核酸內(nèi)切酶。已經(jīng)從近300中微生物中分離出了500余種限制性核酸內(nèi)切酶。第8頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶的分類1.限制修飾活性2.內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3.限制輔助因子4.切割位點(diǎn)5.特異性切割6.基因克隆中I型單一多功能的酶3種不同亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特異性位點(diǎn)1000bp不是無(wú)用II型限制酶和修飾酶分開單一成分Mg2+特異性位點(diǎn)及其附近是非常有用III型雙功能酶2種亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特異性位點(diǎn)3‘端24-26bp處是有用第9頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶的命名1、寄主菌屬名的第一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母組成3個(gè)斜體字母的略語(yǔ)表示酶來(lái)源的菌種名稱，如大腸桿菌Escherichiacoli

表示為Eco,流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae

表示為

Hin；2、用一個(gè)正體字母表示菌株的類型，比如EcoR、Hind；3、如果一種特殊的寄主菌株具有幾個(gè)不同的限制修飾體系，則用羅馬數(shù)字標(biāo)出，比如EcoRI、HindIII。第10頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第11頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月II型限制性核酸內(nèi)切酶的3大特點(diǎn)1、識(shí)別位點(diǎn)的特異性每種酶都有其特定的DNA識(shí)別位點(diǎn)，通常是由4、5、6或7個(gè)核苷酸組成的特定序列（靶序列）。2、識(shí)別序列的對(duì)稱性

靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。3、切割位點(diǎn)的規(guī)范性

雙鏈DNA被酶切后，分布在兩條鏈上的切割位點(diǎn)旋轉(zhuǎn)對(duì)稱（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。第12頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月§2.3核酸的分子結(jié)構(gòu)回文序列所謂回文序列就是指DNA某一片段旋轉(zhuǎn)180。后,順序不變的序列，回文序列中的單鏈可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。雙鏈可形成十字架結(jié)構(gòu)。這種發(fā)夾結(jié)構(gòu)或十字架結(jié)構(gòu)在大腸桿菌細(xì)胞DNA中已有發(fā)現(xiàn).第13頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月§2.3核酸的分子結(jié)構(gòu)核酸分子中的回文序列第14頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月§2.3核酸的分子結(jié)構(gòu)

回文序列中的單鏈可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)第15頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月§2.3核酸的分子結(jié)構(gòu)雙鏈回文序列可形成十字架結(jié)構(gòu)第16頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個(gè)概念粘性末端

cohesive

ends因酶切位點(diǎn)在兩條DNA單鏈上不同（對(duì)稱）酶切后形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈末端結(jié)構(gòu)，酶切產(chǎn)生的兩個(gè)粘性末端很

容易通過(guò)互補(bǔ)堿基的配對(duì)而重新連接起來(lái)。平末端

Bluntend因酶切位點(diǎn)在兩條DNA單鏈上相同，酶切后形成的平齊的末端結(jié)構(gòu)，這種末端不易重新連接起來(lái)。同裂酶

isoschizomers能識(shí)別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同內(nèi)切酶。同尾酶

isocaudamers識(shí)別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。注意：由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識(shí)別。第17頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月幾種II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

第18頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月EcoRI的識(shí)別位點(diǎn)GAATTC5’3’CTTAAG3’5’AATTCG5’-粘性末端HindIII的識(shí)別位點(diǎn)TTCGAAAAGCTT5’3’3’5’AGCTTA5’-粘性末端限制性內(nèi)切酶第19頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月HaeIII的識(shí)別位點(diǎn)PstI的識(shí)別位點(diǎn)GGCC5’3’CCGG3’5’CTGCAG5’3’GACGTC3’5’GGCCCCGG平整末端CTGCAG3’-粘性末端限制性內(nèi)切酶第20頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

經(jīng)同尾酶消化的DNA末端連接示意圖5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’BamHI5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’BglII5’XXXXA

GATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAG

AXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’BamHIBglII第21頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

推測(cè)酶切割位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率對(duì)于推斷DNA酶切片段大小很有用。假定4種核苷酸在DNA分子上出現(xiàn)的頻率相同，那么靶序列為6個(gè)核苷酸的內(nèi)切酶在每46（=4096）個(gè)核苷酸中酶切位點(diǎn)就有一次出現(xiàn)機(jī)會(huì)。據(jù)此推算，一條4900bp長(zhǎng)的DNA中有12個(gè)6核苷酸識(shí)別序列的酶切位點(diǎn)（49000/4096）。但事實(shí)上并非真正如此，因?yàn)镈NA分子中4種堿基的出現(xiàn)頻率并不均等。識(shí)別位點(diǎn)在DNA分子上出現(xiàn)的頻率第22頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2、限制性核酸內(nèi)切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶第23頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

一個(gè)酶單位（U）指：在理想的反應(yīng)條件（適宜的緩沖液和反應(yīng)溫度，通常為37℃）下，50L反應(yīng)體系中完全降解1gDNA所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有：A。DNA的純度和甲基化程度B。甘油的含量（不超過(guò)5%）C。反應(yīng)體系中的離子強(qiáng)度D。反應(yīng)體系的pH值F。反應(yīng)的溫度條件（通常為37℃

）酶單位的定義和影響酶活性的因素Buffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L

第24頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月酶切反應(yīng)的基本步驟＋－電泳紫外分析37℃1h加反應(yīng)液CKMBuffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L

1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT第25頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章基因操作的工具酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用第四節(jié)修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.第26頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、DNA連接酶作用的特點(diǎn)2、DNA連接酶的反應(yīng)條件3、DNA連接的策略第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第27頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)

環(huán)形DNA分子的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家相信一定有一種能連接這種Nick的酶存在。

1967年，世界上幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條

DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶——DNA連接酶（ligase）。DNA連接酶由大腸桿菌基因組DNA編碼，以NAD+作為能源輔助因子；T4DNA連接酶

由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼，以ATP作為能源輔助因子。（1970年）容易制備，而且可以連接完全配對(duì)的平末端DNA分子，所以在基因克隆中應(yīng)用廣泛。NickNick第28頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接酶作用的特點(diǎn)A.連接的兩條鏈必須分別具有3′端自由羥基（-OH）和5′端磷酸基團(tuán)（-P），而且只有這兩個(gè)基團(tuán)彼此相鄰時(shí)才能進(jìn)行連接反應(yīng)；B.在羥基和磷酸基團(tuán)間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過(guò)程，因此連接反應(yīng)必須有能量分子的參與，通常有兩種能量分子，即ATP和NAD+。OKNO第29頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月載體去磷防止自連的應(yīng)用示例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH連接酶連接酶連接酶堿性磷酸酶2Pi寄主修復(fù)缺口載體自連或產(chǎn)生二具體等第30頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、DNA連接酶作用的機(jī)理2、DNA連接酶的反應(yīng)條件3、DNA連接的策略第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第31頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA連接反應(yīng)的條件

連接反應(yīng)最佳溫度為37℃，但是此時(shí)粘性末端間氫鍵結(jié)合不夠穩(wěn)定，而且酶活性也會(huì)迅速降低。比如，EcoRI粘性末端連接部位只有4個(gè)堿基對(duì)，很容易斷開。所以通常在4-15℃連接。影響連接效率的因素有：A.溫度（最主要的因素）B.ATP的濃度(10M-1M)C.連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）D.反應(yīng)時(shí)間（通常連接過(guò)夜）E.插入片段和載體片段的摩爾比轉(zhuǎn)化4℃過(guò)夜加反應(yīng)液CK-重組菌落CK+第32頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、DNA連接酶作用的機(jī)理2、DNA連接酶的反應(yīng)條件3、DNA連接的策略第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第33頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月粘性末端DNA片段的連接NickNick第34頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月平末端DNA片段的末端加尾連接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA連接酶第35頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月平末端DNA片段加接頭連接法

銜接物(linker)，也叫接頭，是有人工化學(xué)合成的一段10-12個(gè)核苷酸的DNA雙鏈，其中包含有1個(gè)或幾個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。使用時(shí)只須將銜接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，就可獲得能產(chǎn)生粘性末端的DNA片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4連接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA第36頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章基因操作的工具酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用第四節(jié)修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.第37頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用第38頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

大腸桿菌DNA聚合酶I

（E。ColiDNApolI）是KornbergA.1956年首先從大腸桿菌E。Coli細(xì)胞中分離出來(lái)的。它是一種多功能性的酶，包括3種不同的酶活力：5′-3′聚合酶活性以雙鏈DNA為模板，催化單核苷酸結(jié)合到引物的3′末端，并不斷延伸。5′-3′外切酶活性將雙鏈DNA中游離的5′末端逐個(gè)切去。3′-5′外切酶活性將游離的雙鏈或單鏈DNA的3′端降解。不過(guò)對(duì)于雙鏈的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T第39頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

大腸桿菌DNA聚合酶I的三種用途A.制備高比活度的DNA探針

利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于DNA連接后的大缺口填充

利用5′--3′的聚合酶活性。C.用于DNA的序列分析

利用5′--3′的聚合酶活性。第40頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

大腸桿菌聚合酶I的應(yīng)用示例CCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+缺口轉(zhuǎn)移(Nicktranslation)CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCT第41頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月缺口轉(zhuǎn)移(Nicktranslation)第42頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用第43頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

Klenow片段的主要用途Klenow片段大腸桿菌聚合酶I全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。Klenow片段的主要用途修補(bǔ)限制性酶消化DNA形成的3′隱蔽末端標(biāo)記DNA片段的末端cDNA克隆中第二鏈cDNA的合成DNA序列的測(cè)定GAACTTAA第44頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用第45頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

T4DNA聚合酶的特點(diǎn)T4DNA聚合酶是

從T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來(lái)的，它和Klenow片段一樣具有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶I的活性高200倍。特別是，T4DNA聚合酶還有第三種活力—取代反應(yīng)：如果反應(yīng)體系中僅存在一種dNTP，這時(shí)T4DNA聚合酶就會(huì)表現(xiàn)出3′→5′外切酶活力，從雙鏈DNA的3′開始降解，直到露出和缺乏的那中dNTP互補(bǔ)的堿基，然后就在此位置發(fā)生合成和取代反應(yīng)。CGTCGCGCAGCGCGTGCAGCGdTTPMg++CGGCAGCGdTTPMg++第46頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

T4DNA聚合酶的用途1、以填充反應(yīng)標(biāo)記有5′端延伸的雙鏈

DNA片段2、以取代反應(yīng)標(biāo)記延伸末端或平頭末端的雙鏈DNA片段3、用于DNA序列分析第47頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用第48頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

逆轉(zhuǎn)錄酶—Reversetranscriptase逆轉(zhuǎn)錄酶是

一種可以有效地將mRNA轉(zhuǎn)錄成為DNA的酶，其產(chǎn)物稱為cDNA(complementaryDNA).實(shí)際上，它也是一種RNA依賴的DNA聚合酶。逆轉(zhuǎn)錄酶首先是1970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。這兩個(gè)課題組的論文都發(fā)在了同一期的《Nature》雜志上。主要用途是

將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA以制備基因片段。3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

第49頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二章基因操作的工具酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用第四節(jié)修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.第50頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）4、堿性磷酸化酶第四節(jié)修飾性工具酶第51頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月末端轉(zhuǎn)移酶的特性末端轉(zhuǎn)移酶是一類不依賴于DNA模板的DNA聚合酶。該類酶可以在沒(méi)有模板鏈存在的情況下，將核苷酸連接到DNA的在3‘羥基，特別是對(duì)于平末端的雙鏈DNA末端加尾十分有效。最常見(jiàn)的用途是在酶切產(chǎn)生的平末端加尾以便于創(chuàng)造粘性的互補(bǔ)末端。第52頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

Charactersofthepolymerase

Terminaltransferaseisthecommonnameoftemplate-independantDNApolymerase.Thisenzymeisisolatedfromcalfthymusandcanaddnucleotidesto3'hydroxylgroupsofDNAwithouttheneedforatemplate.The

bestprimeris

doublestrandedDNA(dsDNA)withbluntends.Purinebasesrequiremagnesiumionsandpyrimidinebasesrequirecobaltions.Theenzymebuildsup

homopolymerchains

ifsuppliedwithappropriatedNTPs.ThemostcommonuseforthisenzymeisthegenerationofcomplementarytailsonDNAfragmentsandvectorscutwithrestrictionenzymeswhichgeneratebluntends.第53頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月平末端DNA片段的末端加尾連接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA連接酶第54頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、末端轉(zhuǎn)移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）3、堿性磷酸化酶（Alkalinephosphatase）第四節(jié)修飾性工具酶第55頁(yè)，課件共65頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

核酸酶SI的特性

這是一種從米曲霉（Aspergillusoryzae）中分離的可以降解單鏈DNA或RNA的外切酶。其主要用途有：A、在cDNA合成過(guò)程