離心分離和沉淀分離

離心分離和沉淀分離第1頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月0概述固液分離的常用手段分類：離心沉降離心過濾超離心第2頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月1離心沉降原理球形粒子沉降在離心力場中第3頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月1離心沉降原理Ｆ<３０００常速離心機Ｆ＝３０００-５００００中速離心機Ｆ≥５００００高速離心

第4頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月離心機的種類與用途按速度和離心力：1、常速離心機最大轉速8000rpm(r/min),相對離心力(RCF)104g以下,用于細胞、菌體和培養(yǎng)基殘渣等分離；2、高速（冷凍）離心機

1×104-2.5×104rpm，相對離心力104~105g,用于細胞碎片、較大細胞器、大分子沉淀物等分離；3、超速離心機轉速2.5-8×104rpm，相對離心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白質、細胞器、病毒分離純化；檢測純度；沉降系數(shù)和相對分子量測定等。第5頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月瓶式離心機1）斜角式離心機是一類結構最簡單的實驗室常用離心機，指離心管腔與轉軸成一定傾角的轉子；角度越大，沉降越結實，分離效果越好，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉子中沉降時，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側會出現(xiàn)顆粒沉積。第6頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月2）平拋式離心機平拋式離心機一類結構簡單的實驗室常用的低中速離心機，轉速一般在3000-6000rpm。轉子活動管套內的離心管，靜止時垂直掛在轉頭上，旋轉時隨著轉子轉動，從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）。顆粒在水平轉子中的沉降是沿管子軸向移動。樣品便于收集受振動和變速攪亂后對流現(xiàn)象小，但轉頭結構復雜，最高轉速相對要低容量也小一些。

第7頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月平拋式離心機轉子第8頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月2離心沉降設備瓶式離心機也稱平拋式離心機結構最簡單的實驗室常用的低，中速離心機，轉速一般在3000-6000rpm。第9頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月2離心沉降設備管式離心機液-液分離；液-固分離結構簡單轉速很高可連續(xù)操作（液-液）第10頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月2離心沉降設備碟式離心機固體的沉降距離極短，分離效果較好。碟片間的距離一般為0.5~2.5mm,與被分離物料的性質有關。液-液分離；液-固分離連續(xù)操作第11頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月2離心沉降設備多室式離心機增加了沉降面積，減少了沉降距離同時還有粒度篩分的作用常用于抗菌素液－液萃取分離間歇式生產第12頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月管式離心機3離心沉降的計算ＨＲ０Ｒ１rz管壁第13頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月沉淀分離第14頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月概述

沉淀（定義）

是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程。沉淀具有選擇性

有選擇地沉淀雜質有選擇地沉淀所需成分優(yōu)點：操作簡單、經濟、濃縮倍數(shù)高缺點：針對復雜體系而言，分離度不高、選擇性不強第15頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月概述

沉淀操作常在發(fā)酵液經過過濾和離心（除去不溶性雜質及細胞碎片）以后進行。操作方式可分連續(xù)法或間歇法兩種，規(guī)模較小時，常采用間歇法。不管哪一種方式操作步驟通常按三步進行：第16頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質的溶解特性蛋白質是兩性高分子電解質在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內部折疊的趨勢，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質的疏水區(qū)大，疏水性強。親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質立體結構的外表面。蛋白質表面由不均勻分布的荷電基團形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構成。第17頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質分子表面的憎水區(qū)域和荷電區(qū)域第18頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月概述沉淀法操步驟：沉淀劑粒子生長收集沉淀物過濾離心第19頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月概述沉淀法（1）鹽析法；（2）等電點沉淀法；（3）有機溶劑沉淀法；（4）非離子型聚合物沉淀法；（5）聚電解質沉淀法；（6）高價金屬離子沉淀法等。除第（3）種有機溶劑沉淀法也能適用于抗生素等小分子外，其他各種方法只適用蛋白質等大分子。分類第20頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質鹽析因此，可通過降低蛋白質周圍的水化層和雙電層厚度（ζ電位）降低蛋白質溶液的穩(wěn)定性，實現(xiàn)蛋白質的沉淀。蛋白質穩(wěn)定因素水化層雙電層使蛋白質形成穩(wěn)定的膠體溶液靜電排斥作用第21頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質鹽析中性鹽蛋白質脫水中和電荷沉淀第22頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月鹽析法機理（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化力，于是蛋白質分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質分子因熱運動碰撞聚集。（2）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域，由于憎水區(qū)域間作用使蛋白質聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越易沉淀。（3）中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白質溶液后，蛋白質表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導致蛋白溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而沉淀。第23頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月第24頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質鹽析

第25頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月第26頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月鹽析用鹽的選擇鹽析作用要強鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經濟第27頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月鹽析操作蛋白質鹽析

①直接加入固體(NH4)2SO4粉末，工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入，并充分攪拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高；②是加入硫酸銨飽和溶液，在實驗室和小規(guī)模生產中，或(NH4)2SO4濃度不需太高時，可采用這種方式，它可防止溶液局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。第28頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質鹽析陰離子：檸檬酸＞PO43-

＞SO42-

＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-陽離子：NH4+＞K+＞Na+＞高價陽離子硫酸銨：（1）價廉；（2）溶解度大，穩(wěn)定蛋白質；（3）水解變酸；（4）高pH釋氨，腐蝕；（5）殘留產品有影響。鹽析效果第29頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月影響因素蛋白質鹽析pH變化溫度變化等電點附近有極小值隨溫度升高減小，熱促失水膜第30頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月lgS第31頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月第32頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質鹽析鹽析注意事項：

(1)穩(wěn)定pH用磷酸緩沖液（2）硫酸銨加入后體積變大（3）選擇飽和度（4）分步鹽析（5）初始蛋白濃度第33頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月㏒S=β-ＫsＩS—蛋白質的溶解度，g/L;I－離子強度，

I=1/2∑mizi2mi—離子i的摩爾濃度；Zi—所帶電荷β—常數(shù)，圖中截距Ks—鹽析常數(shù)，圖中直線斜率Cohn經驗式

蛋白質溶解度與鹽濃度的關系第34頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月等電點沉淀法原理：調pH至等電點，使蛋白質所帶凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，形成沉淀。適用于疏水性較強的蛋白質第35頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月pH=pI第36頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月等電點沉淀法（1）適用于疏水性強的蛋白質（2）中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，同時最低溶解度會有所增大。（3）無機酸通常價格便宜，無毒（4）蛋白質對低pH敏感，易失活操作注意事項第37頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月等電點沉淀實例從豬胰臟中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右進行等電點沉淀，除去共存的許多酸性蛋白質(pI=3．O)。工業(yè)生產胰島素(pI＝5.3)時：先調pH至8.0除去堿性蛋白質，再調pH至3.0除去酸性蛋白質(同時加入一定濃度的有機溶劑以提高沉淀效果)。第38頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月等電點沉淀法細胞色素C洗脫液（離交）+硫酸胺（飽和度86%）低溫離心上清液調pH4.8-5.1產物↓沉淀（雜蛋白）第39頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月有機溶劑沉淀法

概念：在含有溶質的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出。優(yōu)點在于：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質等只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；缺點是1）對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，2）操作要求在低溫下進行。3）成本高第40頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月A降低溶劑介電常數(shù).B破壞水化膜：C相反力：有機溶劑沉淀法機理減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質分子間的相互作用力，從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞水化層疏水基團暴露并有機溶劑疏水基團結合形成疏水層第41頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月降低介電常數(shù)破壞水化膜第43頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的有機溶劑沉析劑選擇依據(jù)：水溶性要好介電常數(shù)要小致變性作用要?。状迹┒拘砸?、揮發(fā)性適中容易獲取沉淀蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀劑乙醇：沉析作用強，揮發(fā)性適中，無毒，常用于蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣；第44頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月溫度

使用有機溶劑沉淀時，操作必須在低溫下進行，有機溶劑沉淀法的影響因素pH值：

pH多控制在待沉蛋白質的等電點附近。第45頁，課件共48頁，創(chuàng)作于2023年2月

舉例：固體發(fā)酵生產α-淀粉酶的提取工藝研究

α-淀粉酶（米曲霉）菌體+水過濾水抽提清液

加乙醇（70%）攪拌α-淀粉酶↓

*pH影響收率%酶活收率酶活

6.5pH*適宜的pH5.6~6.0

*

溫度影響

收率%酶活酶活

收率

1020T℃

*

適宜的溫度10~20℃