現(xiàn)代生物技術(shù)在發(fā)酵中的應(yīng)用

現(xiàn)代生物技術(shù)在發(fā)酵中的應(yīng)用第1頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

生物技術(shù)的內(nèi)容大致分為兩個方面：直接型生物細(xì)胞的利用技術(shù)和模擬型生物細(xì)胞的利用技術(shù)。以現(xiàn)代前沿技術(shù)來說，一般認(rèn)為有四方面：即基因操作技術(shù)；細(xì)胞融合技術(shù)；細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)和生物反應(yīng)器技術(shù)?？筛爬榛蚬こ?，細(xì)胞工程，發(fā)酵工程和酶工程，與生化工程關(guān)系也很密切，也可并入，構(gòu)成五大工程。生物技術(shù)的應(yīng)用，已經(jīng)取得相當(dāng)大的成果，特別是在醫(yī)藥方面，已經(jīng)開發(fā)展出了不少的新藥，見表1。生物技術(shù)中，當(dāng)前人們最感興趣的是基因工程和細(xì)胞工程，它們是生物技術(shù)的主導(dǎo)領(lǐng)域，也是熱點(diǎn)。形成獨(dú)特產(chǎn)業(yè)的發(fā)酵工程和酶工程等也是生物技術(shù)中的重要組成部分。這幾方面的內(nèi)容是相互聯(lián)系和互相促進(jìn)的。基因工程和細(xì)胞工程常常是發(fā)酵工程和酶工程的基礎(chǔ)，所以現(xiàn)代發(fā)酵工程包括整個生物工藝過程。作為發(fā)酵工業(yè)來說，除了傳統(tǒng)的利用天然微生物發(fā)酵生產(chǎn)初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物外，由于生物技術(shù)的出現(xiàn)，發(fā)酵工業(yè)所涉及的范圍得到擴(kuò)大，生產(chǎn)技術(shù)得到改造，因而發(fā)酵生產(chǎn)能力和控制水平大為提高。第2頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

DNA重組技術(shù)獲得的部分藥品

藥物名稱適應(yīng)性

胰島素

糖尿病

生長激素侏儒癥血清白蛋白外科休克燒傷蛋白因子Ⅶ

血友病尿激酶心臟病發(fā)作、中風(fēng)組織血纖維蛋白溶酶原活化劑血栓癥干擾素癌癥病毒感染淋巴激活素癌癥自動免疫病感染白細(xì)胞介素是一種淋巴因子具多種功能腫瘤壞死因子(TNF)抗李斯特菌致死攻擊、血管生成等心鈉素（ANP）具有強(qiáng)利尿、擴(kuò)張血管和降壓作用等

第3頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

像基因工程所獲得的工程菌一樣，許多哺乳動物的基因克隆在大腸桿菌等宿主中能夠得到表達(dá)等等。使用小鼠體內(nèi)法生產(chǎn)單克隆抗體，產(chǎn)品常含有毒性雜質(zhì)和不易大量生產(chǎn)等缺點(diǎn)，目前也采用同微生物發(fā)酵一樣的發(fā)酵罐的生物反應(yīng)器來進(jìn)行催化反應(yīng)，獲得所需的產(chǎn)物。酶工程中的固定化細(xì)胞（或酶）也可用類似發(fā)酵罐的生物反應(yīng)器來進(jìn)行催化反應(yīng)，獲得所需的產(chǎn)物。這些事實(shí)都說明它們之間的密切關(guān)系，也說明發(fā)本酵（或類似發(fā)酵）技術(shù)在制得產(chǎn)品中的地位。另外，計(jì)算機(jī)技術(shù)用于發(fā)酵控制也已趨于廣泛。一.工程菌的發(fā)酵1.工程菌的來源和應(yīng)用

基因工程是在生物體外對DNA分子進(jìn)行重新組合，然后克隆到適合的宿生細(xì)胞，進(jìn)行增殖和表達(dá)的遺傳操作。所得重組體菌株即是工程菌。獲得它的基本過程如圖。

基因工程的關(guān)鍵問題在于目的基因在宿主細(xì)胞中能否表達(dá)，即DNA在宿主細(xì)胞中能否轉(zhuǎn)錄和翻譯，表達(dá)形成的產(chǎn)物在胞內(nèi)不被分解，并能分泌到胞外。而基因表達(dá)過程是多層次的，因此影響基因表達(dá)的因素也是多方面的。第4頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月第5頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月比較理想的、能夠成為工業(yè)使用的基因工程菌應(yīng)具備下列條件：1）發(fā)酵產(chǎn)品是高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率的，當(dāng)然也是分泌型菌株；2）菌株能利用常用的碳源（如糖蜜、淀粉等），并可進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)；3）菌株是不致病的，也不產(chǎn)生內(nèi)毒素；4）發(fā)酵所產(chǎn)生的熱量和需氧量都較低，發(fā)酵溫度也適當(dāng)；5）代謝控制容易進(jìn)行；6）能進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹亟MDNA，并且穩(wěn)定，重組的DNA不易丟失。基因工程技術(shù)已趨于成熟，所得工程菌已得到應(yīng)用，并已開發(fā)出不少產(chǎn)品投入市場如胰島素、干擾素、生長激素和乙型肝炎疫苗等，還有幾十種可能成為藥物的產(chǎn)品正在開發(fā)中。在氨基酸工程菌組建上，也獲得了成功，如高產(chǎn)的蘇氨酸工程菌。在抗生素生物合成上，在分析和分離生物合成基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和表達(dá)調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上，已成功地把基礎(chǔ)因工程技術(shù)用于提高抗生素的產(chǎn)量上，如將頭孢菌素生物合成的限制性擴(kuò)環(huán)酶基因克隆到產(chǎn)生菌中，使頭孢菌素C的產(chǎn)量提高了15%。我國在基因工程研究開發(fā)上，也取得了不少成就：已獲得青霉素酰化酶基因工程菌，并中試成功，達(dá)195u/ml水平；利用工程菌也中試成功人a型干擾素等。第6頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月2、工程菌的培養(yǎng)（1）基因重組細(xì)胞的種類宿主細(xì)胞可以采用原核的大腸桿菌和枯草桿菌、真核細(xì)胞的酵母菌和哺乳動物細(xì)胞等。所以，生產(chǎn)基因重組產(chǎn)物就有不同的菌體或細(xì)胞。但當(dāng)前生產(chǎn)上使用多的仍以大腸桿菌為主，因?yàn)樵诖竽c桿菌中，多種哺乳動物和其他微生物的蛋白基因能夠得到高效表達(dá)，產(chǎn)物能得到過量生產(chǎn)、產(chǎn)量可達(dá)大腸桿菌菌體總蛋白的50%（如人胰島素）。這就為生產(chǎn)多種蛋白藥物（如白細(xì)胞介素-2，人生長激素、干擾素等），提供了基礎(chǔ)。但大腸桿菌不具備分泌系統(tǒng)，產(chǎn)生的產(chǎn)物以包含體（inclusionbody）形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，這給分離純化造成了困難。因此，人們才研究能分泌蛋白的酵母系統(tǒng)和枯草桿菌系統(tǒng)（2）工程菌的培養(yǎng)

工程菌的培養(yǎng)與普通微生物的好氣培養(yǎng)無大差異，但有其特點(diǎn)。從培養(yǎng)工程來看，其主要因素有：營養(yǎng)源（碳源、氮源、氨基酸、溶解氧等）濃度的控制和有毒代謝產(chǎn)物的排除。在生物學(xué)上還應(yīng)考慮：質(zhì)粒的穩(wěn)定性、質(zhì)?？截悢?shù)的控制、轉(zhuǎn)錄效率的提高與控制、翻譯效率的提高以及菌體向外分泌產(chǎn)物等因素。因此，工程菌的開發(fā)研究仍須重視培養(yǎng)技術(shù)，才能獲得大量產(chǎn)物。第7頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

①培養(yǎng)裝置在進(jìn)行以工業(yè)化為目的DNA重組實(shí)驗(yàn)，以及為生產(chǎn)異種基因產(chǎn)物而培養(yǎng)重組菌，應(yīng)采用簡便易行的培養(yǎng)系統(tǒng)。以大腸桿菌為主的宿生的培養(yǎng)多使用一般的通氣攪拌罐?；蛑亟M動物細(xì)胞的培養(yǎng)，實(shí)際上與過去動物細(xì)胞培養(yǎng)一樣，所用的培養(yǎng)裝置和措施與微生物培養(yǎng)并不相同。

工程菌的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)仍使用常規(guī)的培養(yǎng)皿、試管、玻璃瓶等培養(yǎng)器。實(shí)驗(yàn)者應(yīng)按實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則的要求，謹(jǐn)慎進(jìn)行操作，應(yīng)使用移液搶處理重組體，操作應(yīng)在安全柜（或室）中進(jìn)行，目前已有規(guī)定的細(xì)則，以防止工程菌外漏和擴(kuò)散。中間試驗(yàn)或大量提純產(chǎn)物時，必須進(jìn)行重復(fù)性好的穩(wěn)定培養(yǎng)。要取得大量培養(yǎng)液或培養(yǎng)數(shù)據(jù)，要用帶各種傳感器的培養(yǎng)罐，以測定和控制pH值、溶解氧、底物濃度等參數(shù)。許多培養(yǎng)數(shù)據(jù)還可通過聯(lián)機(jī)取得，或經(jīng)自動分析記錄下來，這樣自動化系統(tǒng)能有效地減少實(shí)險操作者與基因重組體的接觸機(jī)會。密閉型通氣攪拌培養(yǎng)罐按采用高壓蒸氣滅菌。工程菌的培養(yǎng)裝置既要防止外界微生物侵入罐內(nèi)，污染雜菌，又必須不使重組體外漏。這是與沿用的通氣攪拌式培養(yǎng)罐的區(qū)別所在。第8頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月②培養(yǎng)基和高密度發(fā)酵

微生物生產(chǎn)的蛋白質(zhì)類產(chǎn)物，常是一種粗品，因此可以使用各種復(fù)雜培養(yǎng)基。但工程菌的產(chǎn)物多屬于人或畜體內(nèi)蛋白質(zhì)，需要有很高的純度，否則，不能在體內(nèi)使用，所以，發(fā)酵生產(chǎn)須要有嚴(yán)格的要求。工程菌發(fā)酵有兩條基本要求，首先是要使菌體生長良好，獲得高濃度菌體（即高密度發(fā)酵），這樣才能得到最多的產(chǎn)物；其次是發(fā)酵所用培養(yǎng)基的成分必須保持盡可能的簡單，以便分離產(chǎn)物。

據(jù)報道，培養(yǎng)大腸桿菌最高可得干重菌體125g/L，釀酒酵母可得145g/L?？莶輻U菌大概可得干菌體20-40g/L。這些數(shù)值還不是工程菌培養(yǎng)的結(jié)果。我國對人a1型干擾素工程菌（大腸桿菌K12系BMH71-18株），進(jìn)行高密度發(fā)酵，得到100.25g/L的菌體。這與培養(yǎng)非工程菌的菌量相接近。大腸桿菌、其他細(xì)菌和酵母菌在合成培養(yǎng)中都能良好地生長。工程菌發(fā)酵所使用的培養(yǎng)基也是合成培養(yǎng)基，包括葡萄糖、銨鹽和無機(jī)鹽等。其組成必須滿足獲得高濃度菌體的要求，發(fā)酵中間過程還必須補(bǔ)加碳源和氮源，也用氨水來調(diào)節(jié)控制發(fā)酵pH。其他的培養(yǎng)條件，如攪拌轉(zhuǎn)速（與剪切力有關(guān)）、溶解氧、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)pH、接種齡和接種量等條件，對菌體生長和產(chǎn)物產(chǎn)量都有影響。

第9頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

從安全性來考慮菌體營養(yǎng)源的問題，培養(yǎng)工程菌的外界條件至少要遵守物理密封（P1～P4）方法中的P1級規(guī)定。從生物安全性來考慮，常采用維生素或氨基酸營養(yǎng)缺陷型的工程菌。維生素缺陷型僅需極少量維生素，過量也無影響。在培養(yǎng)氨基酸缺陷型菌株達(dá)到高濃度菌體之前，培養(yǎng)一開始就要加入必需量的氨基酸，這樣就會因過量氨基酸而抑制菌的生長。為此，可采用調(diào)節(jié)pH的同時補(bǔ)加氨基酸混合液和葡萄糖的方法，使整個培養(yǎng)期間葡萄糖和氨基酸的濃度幾乎保持恒定，培養(yǎng)大腸桿菌C600菌株時獲得60g/L干菌體。菌體對葡萄糖及氨基酸的收得率因培養(yǎng)條件不同而不同。以葡萄糖、蘇氨酸、亮氨酸、組氨酸、色氨酸為營養(yǎng)源時，平均每克所得菌體量（干重）分別為0.3、2.5、15、40、40g。以獲得1g菌體所需要營養(yǎng)源的價格進(jìn)行比較，蘇氨酸的費(fèi)用最高，因此要避免用蘇氨酸缺陷型作基因重組用的宿主菌，最好使用維生素缺陷型菌株。③菌株和質(zhì)粒的穩(wěn)定性

在工業(yè)發(fā)酵運(yùn)行中，菌株必須具有很好的穩(wěn)定性。對工程菌發(fā)酵來說，細(xì)胞中的質(zhì)粒穩(wěn)定性和質(zhì)粒內(nèi)在穩(wěn)定性同樣重要。質(zhì)粒保存率高，相應(yīng)地就會得到高濃度的產(chǎn)物。在進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)時，因菌體濃度低，無須考慮質(zhì)粒穩(wěn)定性的問題，但在研究工業(yè)化生產(chǎn)時，這是一個極為重要的課題。在含有抗生素抗性標(biāo)記相應(yīng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，保持選擇壓力。第10頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

有關(guān)質(zhì)粒保持和穩(wěn)定性的遺傳和環(huán)境的影響因素，研究的比較多。有人報道，大腸桿菌RRI中的pBR322質(zhì)粒可以維持約60代。以這樣穩(wěn)定的細(xì)胞，1個細(xì)胞可以分裂足夠多的次數(shù)，產(chǎn)生細(xì)胞密度為10g/L的培養(yǎng)液達(dá)11500L。在24（或少于24）小時，就能產(chǎn)生出象胰島素、生長激素、干擾素等蛋白質(zhì)。因此就不需要利用抗生素耐藥性來保持穩(wěn)定性，而且另外的方法，如調(diào)節(jié)溫度，使得在相當(dāng)短的時間內(nèi)，得到很高水平的基因表達(dá)。3.安全問題(1)重組DNA實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則

1974年，提出了DNA重組實(shí)驗(yàn)具有潛在生物危險的問題。后來就制訂了在實(shí)驗(yàn)室中構(gòu)建工程菌及使用工程菌的實(shí)驗(yàn)應(yīng)遵循的準(zhǔn)則，以保證實(shí)驗(yàn)的安全和推動重組DNA的研究。這些準(zhǔn)則是采用物理密封（P1～P4）和生物學(xué)密封（B1～B2）兩種方法。

物理密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實(shí)驗(yàn)人員和向外界擴(kuò)散。實(shí)驗(yàn)規(guī)模在20L以下時，物理密封由密封設(shè)施、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)所組成。密封程度分為P1、P2、P3和P4級，數(shù)字越大，密封水平越高。生物學(xué)密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體，通過這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴(kuò)散。第11頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

企業(yè)中進(jìn)行重組菌培養(yǎng)的設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)有LS-1和LS-2。LS-2相當(dāng)嚴(yán)格，工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)在LS-1的設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)下培養(yǎng)。LS-1標(biāo)準(zhǔn)要點(diǎn)是：使用防止重組體外漏、能在密閉狀態(tài)下進(jìn)行內(nèi)部滅菌和培養(yǎng)裝置；培養(yǎng)裝置的排氣由除菌器排出；使用易產(chǎn)氣溶膠的設(shè)備時，要安裝可收集氣溶膠的安全箱等。設(shè)計(jì)用于基因重組菌的培養(yǎng)裝置時，不僅要考慮外部雜菌侵入，還要防止重組菌的外漏。此外，培養(yǎng)后的菌體分離、破碎等處理也必須在安全柜內(nèi)進(jìn)行，或是采用密閉型的設(shè)備。(2)防止基因重組菌外漏的措施

在普通通氣攪拌培養(yǎng)罐培養(yǎng)菌體時，可能發(fā)生外漏的部分和操作有：A排氣；b機(jī)械密封；c取樣；d培養(yǎng)后的滅菌；e接種；f放罐。這些部分和操作均應(yīng)采取一些措施，以防止重組菌外漏。

有關(guān)負(fù)壓潔凈室級別分類技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和P1～P4級實(shí)驗(yàn)室適用工況范圍見下頁表。第12頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月負(fù)壓潔凈室級別分類技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)第13頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月級別工作特點(diǎn)

P1

1.通常用微生物實(shí)驗(yàn)室若干低等真核生物及原生動物、磁菌體

2.可用嘴操作吸管

3.對外人進(jìn)入不限制

4.可在開放性實(shí)驗(yàn)臺上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

P21.禁止外人進(jìn)入實(shí)驗(yàn)區(qū)域無脊椎動物及植物、變溫脊椎動物

2.可能發(fā)生氣溶膠的實(shí)驗(yàn)在II級生物學(xué)安全柜的生殖細(xì)胞和胚胎

3.禁止用嘴操作吸管

4.室內(nèi)設(shè)高壓消互毒柜,對廢棄物先滅菌再排放

P31．由雙重門，氣閘和外部隔離開實(shí)驗(yàn)區(qū)域變溫脊椎動物，無脊椎動物的病毒

2．非本區(qū)人員禁止入內(nèi)植物病毒靈長類以外的哺乳類及鳥類

3．平時送外部空氣送入室內(nèi)，室內(nèi)排氣經(jīng)HEPA

濾后排放室外

4．在II級生物學(xué)安全柜內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

5．實(shí)驗(yàn)人員工作服為室內(nèi)專用，先滅菌后，再拿到外面去洗滌P41．采用獨(dú)立建筑物由隔離區(qū)與外部隔斷

2．根據(jù)相應(yīng)隔離等級，保持室內(nèi)負(fù)壓

3．在密閉型生物學(xué)安全柜（GBLII級）內(nèi)做實(shí)驗(yàn)

4．非本區(qū)人員禁止入內(nèi)

5．取出器材，廢棄物先經(jīng)雙門高壓消毒柜滅菌消毒后，再取出，排出廢液也要先滅菌后再排放

6．實(shí)驗(yàn)入口處設(shè)置國際生物學(xué)危險標(biāo)志靈長類的癌及致癌性研究

第14頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月如何提高高產(chǎn)菌的穩(wěn)定性？★★★★★（1）首先在菌種選育中應(yīng)把菌株產(chǎn)量分布中的穩(wěn)度作為評價菌株的條件之一。不僅以產(chǎn)量高低為基準(zhǔn)；（2）菌株選育中避免使用含有多核的包子和菌絲片斷；（3）用單倍化試劑處理高產(chǎn)菌株，有提高菌株穩(wěn)定性的作用；（4）在培養(yǎng)基中加入某些金屬離子可增加菌株的穩(wěn)定性；（5）利用營養(yǎng)缺陷型和原養(yǎng)型在生理和抗性上的不同，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入抗生素也會有防止回復(fù)突變發(fā)生的效果；（6）在生產(chǎn)過程中應(yīng)盡力減少菌種傳代次數(shù)，這是發(fā)酵工業(yè)中普遍遵循的原則；（7）雜菌污染、發(fā)酵條件改變都能引起發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)量波動，應(yīng)注意區(qū)分原因。第15頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法？

★★★★★

答：1）補(bǔ)加前體類似物；

2）加入誘導(dǎo)物；

3）防止碳分解代謝阻遏或抑制的發(fā)生；

4）防止氮代謝阻遏的發(fā)生；

5）篩選耐前體或前體類似物的突變株；

6）篩選抗抗生素突變株；

7）篩選營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株；

8）抗毒性突變株的選育。第16頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月試述提高初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法？★★★★★

1)使用誘導(dǎo)物；2)除去誘導(dǎo)物----選育組成型產(chǎn)生菌；3)降低分解代謝產(chǎn)物濃度，減少阻遏的發(fā)生；4)解除分解代謝阻遏------篩選抗分解代謝阻遏突變株；5)解除反饋抑制-------篩選抗反饋抑制突變株；6)防止回復(fù)突變的產(chǎn)生和篩選負(fù)變菌株的回復(fù)突變株；7)改變細(xì)胞膜的通透性；8)篩選抗生素抗性突變株；9)選育條件抗性突變株；10)調(diào)節(jié)生長速率；11)加入酶的競爭抑制劑。第17頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月二.動植物細(xì)胞的組織培養(yǎng)1.動物細(xì)胞培養(yǎng)

動物細(xì)胞培養(yǎng)又稱組織培養(yǎng)，是生物技術(shù)的重要組成部分。它與植物細(xì)胞、微生物細(xì)胞培養(yǎng)不同，是將來自動物某些器官或組織的細(xì)胞，在模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件下進(jìn)行體外培養(yǎng)，使之存活和生長。早期的動物細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)際上是以組織片來進(jìn)行培養(yǎng)的，后來改進(jìn)為單細(xì)胞狀態(tài)培養(yǎng)，并作為生產(chǎn)疫苗等物質(zhì)的培養(yǎng)手段。1975年后，建立了以大量制備有用的細(xì)胞成分為目的的培養(yǎng)設(shè)施而進(jìn)入新階段。它不僅用于生產(chǎn)各類疫苗，而且隨著動物細(xì)胞可以作為外來DNA的受體細(xì)胞的DNA重組技術(shù)的成功而得到發(fā)展，已可用來生產(chǎn)人生長激素、人胰島素和干擾素。培養(yǎng)能產(chǎn)生生長激素的基因工程細(xì)胞——猴腎細(xì)胞，最高表達(dá)量，以1×107個細(xì)胞計(jì)，每日可獲得近1mg的產(chǎn)物。使用該法生產(chǎn)的產(chǎn)物有5大類：a.病毒疫苗（如脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病、乙型肝炎等的疫苗）；b.干擾素；c.激素；d.免疫劑；e.人體活性蛋白（如胰島素、血纖維蛋白溶酶原等），其中病毒疫苗生產(chǎn)已得到廣泛應(yīng)用。

第18頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

(1)動物細(xì)胞的性質(zhì)

動物組織經(jīng)物理切碎、切片，或者經(jīng)化學(xué)法或酶法處理所得的細(xì)胞，一般經(jīng)約50代分裂繁殖，便退化死亡。在培養(yǎng)期內(nèi)，染色體數(shù)目和二倍體細(xì)胞特性仍保持正常。這類細(xì)胞被稱為初代培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞在反復(fù)分裂的過程中，有時出現(xiàn)繁殖能力突然培強(qiáng)、幾乎無限制繁殖的細(xì)胞。其形態(tài)、病毒敏感性、抗原性、染色體構(gòu)成等都發(fā)生了變化，完全失去原細(xì)胞的特性。我們把這一類通常所說的癌細(xì)胞稱之為確立細(xì)胞株或株化細(xì)胞。來源于小鼠的L細(xì)胞和來源于人子宮頸癌的Hela細(xì)胞就是有名的確立細(xì)胞株。絕大部分初代培養(yǎng)細(xì)胞只能附著面層著在容器壁上進(jìn)行繁殖，形成單層狀細(xì)胞層，因此稱為貼壁附著細(xì)胞或附著性細(xì)胞。用胰蛋白酶處理這個細(xì)胞層，又可分散成單細(xì)胞，如果繼續(xù)培養(yǎng)又可形成單細(xì)胞層。我們把這種操作稱為移植繼代培養(yǎng)。但這類細(xì)胞與確立細(xì)胞株不一樣，不能無限繁殖，人胚胎組織的細(xì)胞經(jīng)過50次分裂便停止繁殖，為區(qū)別起見，把這類細(xì)胞稱為細(xì)胞株。第19頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

這類細(xì)胞在繁殖初期也有形態(tài)變化，經(jīng)過幾代反復(fù)分裂繁殖后，只有一種能繼續(xù)繁殖的叫做成纖維細(xì)胞，其他形狀的細(xì)胞就消失了。

通常，成纖維細(xì)胞在50代內(nèi)染色體是正常的。成纖維細(xì)胞的繁殖過程是，開始于初代培養(yǎng)細(xì)胞期，隨著世代的增加進(jìn)入對數(shù)繁殖期，大約經(jīng)過30～50代的繁殖，生長速度就變緩慢，進(jìn)入衰減期，這時細(xì)胞分開明繁殖就完全停止，繼而死亡。在此繁殖過程中可能出現(xiàn)有少部分細(xì)胞發(fā)生變異的確立細(xì)胞株。成纖維細(xì)胞在衰減期之前，大部分不具癌化性，仍留初代培養(yǎng)細(xì)胞的性質(zhì)，因此非常安全可靠。如果從中采集繁殖10～20代的細(xì)胞作種細(xì)胞，冷凍保存在-800C，供作生產(chǎn)疫苗、尿激酶、干擾素等的組織培養(yǎng)的種細(xì)胞是可行的。確立細(xì)胞株一般都顯示非常穩(wěn)定的繁殖特性，可以無限增殖，在大多數(shù)情況下，可用于大量懸浮培養(yǎng)。然而，它具有癌化性質(zhì)，用來生產(chǎn)疫苗之類物質(zhì)是帶有一定的危險性?？墒牵蛛x純化支術(shù)的進(jìn)步，有可能除去夾雜有害物質(zhì)。這樣用確立細(xì)胞株生產(chǎn)有用物質(zhì)也是完全可能的。例如：1982年用來自淋巴瘤的確立細(xì)胞株淋巴芽球細(xì)胞作種細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，生產(chǎn)出用于臨床的人干擾素。第20頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）培養(yǎng)條件

動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和微生物培養(yǎng)相似，除要保證無雜菌外，還需要適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)、pH、溫度、溶解氧、罐壓、攪拌轉(zhuǎn)速、滲透壓等。

細(xì)胞培養(yǎng)最適溫度為37+0.5，偏離此溫度，生長和代謝就受到影響，甚至死亡。實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)胞對低溫的耐受性比對高溫強(qiáng)。

大多數(shù)生物體液的pH都接近中性，細(xì)胞生存的pH在6.8～7.6之間，最適pH為7.2～7.4間，當(dāng)pH低于6.0或高于7.6時，生長就受到影響，甚至死亡。但多數(shù)類型的細(xì)胞對偏酸性的耐受性較強(qiáng)，在仿堿性條件下則會很快死亡。作為代謝產(chǎn)物的CO2，除保證體內(nèi)的代謝活動外，還有調(diào)節(jié)pH的作用。大多數(shù)培養(yǎng)基的pH就是利用CO2（NaHCO3緩沖系液）和細(xì)胞代謝產(chǎn)物（特別是乳酸）的組合來控NaHCO3控系統(tǒng)就是血中自然緩沖劑。在培養(yǎng)箱中，可根據(jù)需要持續(xù)地提供一定比例的CO2氣體。在培養(yǎng)罐中，可增加NaHCO3的用量，調(diào)節(jié)CO2濃度來控制培養(yǎng)液的pH，以保持比較穩(wěn)定的pH范圍。

溶解氧的控制，通常都是采用控制通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速和空氣中的氧濃度等因素來實(shí)現(xiàn)，但對脆弱的動物細(xì)胞和易產(chǎn)生泡沫的含血清培養(yǎng)基，只有在維持適宜的通氣量和緩慢的攪拌的基礎(chǔ)上，通過改變空氣中的氧濃度來進(jìn)行?，F(xiàn)在有一種控制溶氧的辦法是將硅氧管浸的培養(yǎng)液中，通過硅氧膜從管內(nèi)供氧。用這種辦法可增加供氧濃度，也可增加氣液接觸面積。適當(dāng)?shù)臐B透壓可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的鹽和葡萄糖濃度來維持。

只有滿足這些基本條件，細(xì)胞才能在體外正常存活和生長。在實(shí)際培養(yǎng)中，還應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞體外培養(yǎng)的難易程度采取不同的具體措施。第21頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）培養(yǎng)基動物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成是一個極為重要的問題。它必須要有足夠的糖、脂肪、蛋白質(zhì)和核酸等代謝所需要的各種成分，包括十幾種必需氨基酸及其他非必需氨基酸、維生素、糖和無機(jī)鹽等。氨基酸只利用L-型；碳源以葡萄糖為最常用，半乳糖也可以，但不能利用雙糖；維生素、無機(jī)鹽是由血清提供或單獨(dú)添加。由于培養(yǎng)基成分的來源不同，有下列幾種培養(yǎng)基。

①合成培養(yǎng)基和血清培養(yǎng)基人們對確立細(xì)胞株的營養(yǎng)要求進(jìn)行了廣泛的研究，出現(xiàn)了許多化學(xué)合成培養(yǎng)基，并在市場上出售。其中最有名的是伊格爾（Eagle）的最低基本培養(yǎng)基，簡稱MEM，見下表。它是由13種必需氨基酸、8種維生素、葡萄糖和無機(jī)鹽所組成。對于細(xì)胞繁殖來說，尚須加入5%-10%的動物血清（如小牛血清）。但從經(jīng)濟(jì)成本或血清供給來看，使用這種培養(yǎng)基都是不現(xiàn)實(shí)的。由于所用血清來源批次不同和含有較多蛋白質(zhì)，培養(yǎng)結(jié)果的重復(fù)性往往較差，細(xì)胞產(chǎn)物還混有異種蛋白，給分離精制帶來很大的困難。

②無血清培養(yǎng)基近年來對無血清培養(yǎng)基進(jìn)行了深入研究，已有商品出售。通常所說的無血清培養(yǎng)基有：基本合成培養(yǎng)基、基本合成培養(yǎng)基加生長因子（功能因子）和基本合成培養(yǎng)基加組織抽提液三種。第22頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

伊格爾的最低基本培養(yǎng)基（MEM）組成

成分濃度，mg/L

成分濃度，mg/LNaCl基壓裂液6.800KCL400NaH2PO4（無水）115MgSO4（無水）93.5CaCl2（無水）200葡萄糖1000L-精氨酸鹽酸鹽126L-半胱氨酸鹽酸鹽（一水）31.4L-酪氨酸36琥珀酸75琥珀酸鈉100重酒石酸膽堿1.8葉酸1肌醇

2煙酰胺1泛酸鈣1

L-組氨酸鹽酸鹽（一水）42L-異亮氨酸52L-亮氨酸52L-賴氨酸鹽酸鹽73L-蛋氨酸15L-苯丙氨酸32L-蘇氨酸48L-色氨酸10L-纈氨酸46鹽酸吡哆醛1核黃素0.1鹽酸硫胺素1生物素0.02卡那霉素60酚紅6

注：L-谷氨酰胺（過濾滅菌）0.292g/L10%碳酸氫鈉水溶液（在密閉狀態(tài)下高壓滅菌）適量

第23頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

前兩種成分明確，又稱已知成分培養(yǎng)基，第三種成分較復(fù)雜，含量不確定。后2種中加有生長繁殖所需的生長因子或組織抽提物，又稱為代血清或無血清培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基應(yīng)考慮的生長因子有上皮細(xì)胞生長因子、T-細(xì)胞生長因子、氫化可的松、胰島素、硒、鐵傳遞蛋白等十八種。該培養(yǎng)基的成分和配比是可以人工控制的，因而具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，可使人工細(xì)胞、變異細(xì)胞在最適生長條件下生長繁殖，產(chǎn)生有用的物質(zhì)，也可簡化產(chǎn)物的分離和精制。這些都是添加生長因子無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)。（4）動物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的動物細(xì)胞可分為懸浮型和貼附型兩大類。

懸浮型細(xì)胞呈圓形，生長時呈懸浮狀態(tài)，通常是某些癌細(xì)胞和血液細(xì)胞。大多數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞是貼附型，培養(yǎng)時貼附在支持物上。由于細(xì)胞類型不同，故有下列幾種培養(yǎng)技術(shù)：

a．懸浮培養(yǎng)；b．貼壁附著培養(yǎng)；c．罐培養(yǎng)技術(shù)第24頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

①懸浮培養(yǎng)

這種培養(yǎng)技術(shù)與培養(yǎng)微生物相似，基本上利用常用的發(fā)酵罐裝置，控制條件（如氧化還原電位、細(xì)胞類密度等）有所不同。曾用一定規(guī)模的發(fā)酵罐培養(yǎng)淋巴芽球細(xì)胞來生產(chǎn)過a-干擾素。在特殊的連續(xù)培養(yǎng)裝置中，使用無血清培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)了該細(xì)胞的高密度發(fā)酵。因此，這種方法可進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)來生產(chǎn)有用物質(zhì)。

②貼壁附著培養(yǎng)

貼附型細(xì)胞的基本特性就是必須附著培養(yǎng)容器壁的介質(zhì)上才能生長繁殖，因此這類細(xì)胞就要采用貼壁附著培養(yǎng)。為了增大附著面積，過去常用扁瓶簡單裝置來進(jìn)行單層靜置培養(yǎng)。由于生物技術(shù)的迫切需要，現(xiàn)已開發(fā)出各種形式的培養(yǎng)裝置，如旋轉(zhuǎn)瓶和多段式托盤培養(yǎng)裝置，已用于B-干擾素的生產(chǎn)。但利用這些裝置仍是手工操作，生產(chǎn)量不大，所以又研制出微載體培養(yǎng)。③微載體培養(yǎng)所用的微載體是交聯(lián)葡萄糖經(jīng)二乙氨基乙基化后所得的離子交換樹脂，其電荷密度規(guī)定在適于細(xì)胞培養(yǎng)的范圍內(nèi)。將這種載體懸浮在培養(yǎng)液中，細(xì)胞便附著在上面進(jìn)行單層狀增殖，密布在整個微載體的球面上。該法雖是貼附培養(yǎng),但仍可用上述的發(fā)酵罐進(jìn)行,所以單位培養(yǎng)面積所占的容積比上述裝置要小的多.如葡聚糖的Cytodewx1微載體,在干燥狀態(tài)下,它的大小為60～87μm,在培養(yǎng)液中可膨脹成160～230μm,每克微粒的表面積約為0.6m2,相于7個標(biāo)準(zhǔn)旋瓶(285mm×110mmф)的表面積。國外已在100L的規(guī)模上大量生產(chǎn)B-干擾素、口蹄疫疫苗。還用近噸級的發(fā)酵罐，實(shí)現(xiàn)了微載體培養(yǎng)動物細(xì)胞的新工藝。所以，該法具有許多優(yōu)點(diǎn)，是大量培養(yǎng)動物細(xì)胞很有前途的方法。第25頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

④罐培養(yǎng)的技術(shù)要點(diǎn)

由于動物細(xì)胞比較脆弱、營養(yǎng)和培養(yǎng)條件要求比較嚴(yán)格等，所以它的培養(yǎng)具有獨(dú)特的性質(zhì)。使用發(fā)酵罐大量培養(yǎng)動物細(xì)胞，應(yīng)掌握下列技術(shù)要點(diǎn)：

a.培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)系統(tǒng)基本上與微生物相似，但有些特殊考慮。突出的有以下幾點(diǎn)：

1---攪拌槳葉的形狀和攪拌轉(zhuǎn)速要有特殊設(shè)計(jì)。動物細(xì)胞膜薄而胞弱，受不了強(qiáng)烈機(jī)械攪拌。攪拌槳葉以3片葉輪為好，也可用塑料纖維制的風(fēng)帆式槳葉。轉(zhuǎn)速要慢，一般是8～20r/min。懸浮培養(yǎng)可加檔板，微載體培養(yǎng)以不裝為好；

2----培養(yǎng)系統(tǒng)必須保持長期無菌狀態(tài)。因動物細(xì)胞生長緩慢，抗雜菌污染措施。培養(yǎng)初期可加少量抗生素（如青霉素、鏈霉素等），但細(xì)脆性工成致密單層時應(yīng)避免加入，因抗生素可使細(xì)胞從微載體表面脫落下來。還有其他一些措施；

3----培養(yǎng)罐、配管的材質(zhì)必須要對培養(yǎng)的細(xì)胞無毒害作用，通常都采用含鈦的不銹鋼。所用橡皮墊圈或橡膠襯墊必須事先經(jīng)過熱水浸泡，否則，橡膠中的培塑劑或添加物就會因蒸汽加熱而溶出，對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用而影響細(xì)胞生長。

b.培養(yǎng)條件的控制動物細(xì)胞培養(yǎng)可以采用分批、流加、半連續(xù)和連續(xù)等培養(yǎng)法。

微載體培養(yǎng)只能用分批培養(yǎng)法。分批培養(yǎng)中，細(xì)胞生長因子要逐漸被消耗掉，并產(chǎn)生乳酸類的代謝產(chǎn)物。這類產(chǎn)物對細(xì)胞生長有抑制作用，因此，在培養(yǎng)過程中要多次更換培養(yǎng)基，保留微載體，棄去上清液，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液。其他的環(huán)境條件，如溫度、DO、pH、罐壓、轉(zhuǎn)速等也要控制。由于動物細(xì)胞大量培養(yǎng)在醫(yī)藥生產(chǎn)上有廣闊的前途，所以為增加細(xì)胞密度最近已開發(fā)出一批新的培養(yǎng)技術(shù)。如灌流培養(yǎng)就是其中一種高密度培養(yǎng)技術(shù)，所能獲得的細(xì)胞密度比常用方法高10～100倍以上，由106個/ml上升到107～108個/ml（而動物組織的細(xì)胞密度過大約是109個/ml），因而生產(chǎn)能力得到明顯提高。

第26頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月2.植物組織細(xì)胞培養(yǎng)

切取植物的葉、莖、根等組織的一部分，將其表面進(jìn)行殺菌后，放入具有營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，這種培養(yǎng)技術(shù)稱為組織培養(yǎng)，或稱之為愈傷組織培養(yǎng)。有時也把在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)或攪拌培養(yǎng)稱為“細(xì)胞培養(yǎng)”?，F(xiàn)在植物組織培養(yǎng)不僅用來繁殖種苗，而且也用于生產(chǎn)生物藥物等。

植物的產(chǎn)物有20類50多種，如醫(yī)藥中的嗎啡、麻黃等生物堿，人參皂苷等皂苷，蒽醌等醌類，維生素E等酚類以及色素、香料和食品等產(chǎn)物。

經(jīng)過近30多年努力，已建立起大規(guī)模生產(chǎn)植物產(chǎn)物的技術(shù)基礎(chǔ)。這種細(xì)胞培養(yǎng)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：可以在人為控制條件下進(jìn)行物質(zhì)生產(chǎn)，克服人工載培的不足；不受季節(jié)氣候的影響，不需占用大量耕地；可以排除病蟲害的侵?jǐn)_；可以進(jìn)行特定的生物轉(zhuǎn)化，克服化學(xué)全成的缺點(diǎn)。因此，該技術(shù)得到了迅速發(fā)展，已成為當(dāng)代生物技術(shù)的一個重要組成部分，也已發(fā)展成為一門新興的科研產(chǎn)業(yè)體系。第27頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理特性

植物細(xì)胞直徑在20~150μm之間，比細(xì)菌大30~100倍，比許多霉菌還大3~10倍。在培養(yǎng)過程中，植物細(xì)胞形態(tài)有明顯的變化，形狀和大小都不相同，體積大約要膨大105倍，其細(xì)胞容積可達(dá)培養(yǎng)液的40%~50%培養(yǎng)的粘度也隨之顯著上升，煙草細(xì)胞對數(shù)生長期的粘度約為培養(yǎng)初期的30倍。

植物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，初期是比較大的游離細(xì)胞，隨后便分裂成一個一個的較小細(xì)胞，但末能分開，有趨向形成細(xì)胞數(shù)目不等的細(xì)胞塊或聚集物，其數(shù)目可達(dá)200個，直徑達(dá)2mm，但植物細(xì)胞有一定的粘性，很易“粘結(jié)”，聚集物的大小還隨細(xì)胞種類而不同。利用細(xì)胞壁降解酶和物理方法，可獲得游離細(xì)胞懸浮液，但又可能恢復(fù)成塊狀。

植物細(xì)胞的生理代謝活性確比微生物小的多，其繁殖增代時間約為25~100小時，而細(xì)菌僅為20分鐘。呼吸率也低，約為1umolO2/（h·106細(xì)胞），所以培養(yǎng)的需氧量和氧傳遞效率的Kla值的要求就低的多，對煙草細(xì)胞來說，Kla在10/h以上，即可保證細(xì)胞有足夠的溶氧進(jìn)行生長。（2）培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件深層液體培養(yǎng)植物細(xì)胞，所用培養(yǎng)基的組成是相當(dāng)?shù)闹匾?，其成分多半是采用適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)基，包括碳源（一般是蔗糖或葡萄糖）、氮源、無機(jī)鹽、各種生長因子（如維生素）和植物生長調(diào)節(jié)劑。1963年研究成功的用于煙草細(xì)胞培養(yǎng)的“RM-1962”完全合成培養(yǎng)基。不只是適用于煙草細(xì)草細(xì)胞，根據(jù)培養(yǎng)的不同目的，調(diào)整部分成分后，就可用于其他愈傷組織或植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。植物細(xì)胞培養(yǎng)的目的，有的是以生產(chǎn)有用的物質(zhì)（包括初級和次級代謝產(chǎn)物）為目的，有的是以種苗生產(chǎn)為目的。第28頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月“RM-1962”培養(yǎng)基，mg/L

NH4NO31650KNO31900

KH2PO4170

H3BO36.2

MnSO422.3

ZnSO4·4H2O8.6KI0.83Na2MoO4·2H2O0.25鹽酸吡哆醇0.5鹽酸硫胺素0.1甘氨酸2.1吲哚醋酸1~30CuSO4·5H2O0.025CoCl2·6H2O0.025CaCl2·2H2O440MgSO4·7H2O370FeSO4·7H2O27.8Na2-EDTA37.3肌醇100煙酸0.5激動素00.4-10蔗糖30g/L瓊脂10g/L成分濃度成分濃度植物細(xì)胞培養(yǎng)大都是在緩慢振蕩或緩慢攪拌條件下進(jìn)行的。用搖瓶培養(yǎng)煙草細(xì)胞時，振蕩頻率都是110r/min，偏心距為3.5cm。在用小發(fā)酵罐培養(yǎng)時，通氣量為0.5v/(v·min)，攪拌速度為50~100r/min。培養(yǎng)溫度是由植物細(xì)胞的特定條件和培養(yǎng)目的來確定的。一般是在25~35。C之間，如西洋參細(xì)胞培養(yǎng)，愈傷組織為２６±0.5。C。當(dāng)然，其他植物細(xì)胞的培養(yǎng)條件還隨植物種類和細(xì)胞狀態(tài)不同而異。第29頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）培養(yǎng)設(shè)備和培養(yǎng)方法用于植物細(xì)胞層培養(yǎng)的裝置，無論是小規(guī)模實(shí)驗(yàn)，還是大規(guī)模培養(yǎng)，基本上都和微生物培養(yǎng)裝置一樣。但由于植物細(xì)胞有上述的結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性，培養(yǎng)裝置也有特殊定要求，如培養(yǎng)液混合要求良好，但剪切力卻不能大，適當(dāng)?shù)腒La以及嚴(yán)格的無菌條件等。曾以產(chǎn)生蒽醌的海巴戟細(xì)胞株為試驗(yàn)細(xì)胞，采用合成培養(yǎng)基，與搖瓶培養(yǎng)裝置、普通槳式攪拌通氣罐、帶卡普蘭槳葉的氣流等氣升式罐和帶氣流管的氣升式培養(yǎng)罐等5種裝置的培養(yǎng)效果進(jìn)行比較，結(jié)果以最后一種帶氣流管的氣升式培養(yǎng)罐的效果為最佳。該裝置的徑高比為0.44,通氣量為0.5v/(v·min),罐中混合狀態(tài)良好,細(xì)胞生長和蒽醌的產(chǎn)量都比較理想.

植物細(xì)胞懸液培養(yǎng)的方法雖然很多,概括起來主要分批培養(yǎng)法、半連續(xù)培養(yǎng)法和連續(xù)培養(yǎng)法，

a.

分批培養(yǎng)操作簡單,應(yīng)用廣泛,實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模均可應(yīng)用.其生長過程與微生物一樣,但生長速度比微生物緩慢,增代時間較長,

煙草細(xì)胞的μ0.044/h(小于酵母的1/10),平均增代時間td為15.8小時整個過程須建立嚴(yán)格無菌培養(yǎng)技術(shù).培養(yǎng)過程一般采用二段培養(yǎng),即微生物的二級發(fā)酵,第一級為種子罐,用適合細(xì)胞生長培養(yǎng)基來繁殖細(xì)胞；第二級為發(fā)酵培養(yǎng)，用成分不同的培養(yǎng)基以生產(chǎn)有用物質(zhì)。b.半連續(xù)培養(yǎng)即在分批培養(yǎng)中，部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行交換的培養(yǎng)方法。該法與分批培養(yǎng)相比，細(xì)胞培殖量及有用物質(zhì)的產(chǎn)率均較高。c.

連續(xù)培養(yǎng)即連續(xù)補(bǔ)料連續(xù)排出培養(yǎng)液，以保持細(xì)胞生長環(huán)境恒定的培養(yǎng)方法。一般說來該法的細(xì)胞生產(chǎn)能力要比分批培養(yǎng)高。但是，由于植物細(xì)胞生長極為緩慢，培養(yǎng)時間長，要長時間維持培養(yǎng)系統(tǒng)的無菌狀態(tài)，在技術(shù)要求上是相當(dāng)苛刻的，所以現(xiàn)在有人將連續(xù)培養(yǎng)改進(jìn)為雙罐連續(xù)培養(yǎng)法，分別控制不同的營養(yǎng)成分，取得了比較好的結(jié)果。第30頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）植物細(xì)胞大量培養(yǎng)的應(yīng)用

植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要用于種苗的生產(chǎn)和次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。前者屬于植物繁殖問題，后者屬于工業(yè)化生產(chǎn)植物產(chǎn)物的問題。這里只簡單介紹后一方面。該技術(shù)的發(fā)展，使得植物細(xì)胞象微生物細(xì)胞一樣，利用發(fā)酵罐來生產(chǎn)過去只能從植物提取的一系列產(chǎn)品。例如，藥用植物的有效成分、香料、蛋白酶抑制劑等重要商品。其培養(yǎng)過程象微生物發(fā)酵一樣，包括三個步驟：a.細(xì)胞株建立，包括愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織經(jīng)單細(xì)胞分離出的優(yōu)良無性繁殖系，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)所得的游離細(xì)胞，供作種子；b.擴(kuò)大培養(yǎng)，種子細(xì)胞經(jīng)多次擴(kuò)大繁殖后，供作發(fā)酵接種材料；c.大罐培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)所要的植物產(chǎn)品。利用這種技術(shù)所得的次級代謝產(chǎn)物的含量比原植物株要高得多。例如，人參的冠癭細(xì)胞、愈傷組織和再分化的根在瓊脂培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾周，所得的粗皂苷的含量分別為21%、19.3%和27.4%，而天然根中的含量僅為4.1%。1968年人參細(xì)胞培養(yǎng)的工業(yè)化生產(chǎn)達(dá)到18m3的規(guī)模。紫草素和小蘗堿的生產(chǎn)也已達(dá)到實(shí)用化水平，其中作為高級染料和治療藥物的紫草素含量達(dá)55%~65%，而天然紫草根的抽提液僅22%~52%，藥源還困難。因此這種培養(yǎng)技術(shù)得到蓬勃發(fā)展，已成為當(dāng)代生物技術(shù)的一個重要組成部分植物細(xì)胞培養(yǎng)已顯示出誘人的前景。第31頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月三.固定化細(xì)胞發(fā)酵

1.概述

酶工程是生物技術(shù)的一個組成部分，包括酶（或細(xì)胞）的固定化技術(shù)及其應(yīng)用，酶常常是不穩(wěn)定的，又不易重復(fù)使用，但固定化后的酶則顯示出穩(wěn)定性明顯提高、可以重復(fù)（或連續(xù)）使用的優(yōu)點(diǎn)。所以，出現(xiàn)了包括具催化功能的固定化酶和固定化細(xì)胞的“固定化生物催化劑”。由于固定化酶（或細(xì)胞）具有簡化生產(chǎn)工序、降低成本、節(jié)約原材料和能源、提高產(chǎn)量和收率以及改善環(huán)境污染的能力，所以在各個領(lǐng)域中，已得到廣泛的應(yīng)用。

固定化技術(shù)與發(fā)酵技術(shù)的比較

第32頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

在發(fā)酵工程中，使用固定化細(xì)胞代替游離細(xì)胞就像固定化酶代替游離酶一樣，具有如下的優(yōu)點(diǎn)：

a.

分批發(fā)酵可用固定化細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)來代替；

b.可以利用高密度的固定化細(xì)胞集合體進(jìn)行發(fā)酵，反應(yīng)效率大大提高；

c.可以人為地控制固定化細(xì)胞的生理狀態(tài)，因?yàn)樵S多化謝產(chǎn)物（或酶）僅僅在細(xì)胞的靜止期才能形成，所以有利于產(chǎn)物的形成。發(fā)酵液的體積也大大減小。由于上述優(yōu)點(diǎn)，固定化細(xì)胞發(fā)酵已代替許多利用連續(xù)酶反應(yīng)的常規(guī)工業(yè)操作，在某些領(lǐng)域中，已（或?qū)ⅲ┤〈恍﹤鹘y(tǒng)發(fā)酵技術(shù)，如已用于甾類激素轉(zhuǎn)化、氨基酸生產(chǎn)和酒精生產(chǎn)等領(lǐng)域。

固定化細(xì)胞與固定化酶相比，雖與反應(yīng)系統(tǒng)有關(guān)，仍具有以下優(yōu)點(diǎn)：

a.

固定化細(xì)胞可以免除固定化酶需要的酶的提取和精制步驟；

b.

固定化細(xì)胞系統(tǒng)對外界條件（如pH）變化的敏感性不強(qiáng)，故有利于控制反應(yīng)；

c.

固定化細(xì)胞允許有高負(fù)荷的載體，而載有固定化酶的載體，由于蛋白-蛋白之間的相互作用，可使酶活下降；

d.

如果反應(yīng)系統(tǒng)需要許多酶和輔因子再生。采用固定化細(xì)胞則是最好的選擇。目前，已經(jīng)形成了固定化細(xì)胞技術(shù)，并已轉(zhuǎn)向重點(diǎn)研究固定化細(xì)胞的特性、反應(yīng)器的選項(xiàng)擇和應(yīng)用。固定化細(xì)胞的種類，也從原來的微生物細(xì)胞擴(kuò)大到動物細(xì)胞、植物細(xì)胞以及DNA重組技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)所組建的細(xì)胞。第33頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月2.固定化細(xì)胞的特性細(xì)胞的固定化方法很多。但任何一種限制細(xì)胞自由流動的技術(shù)，都可用于制備固定化細(xì)胞。根據(jù)已有的資料，固定化細(xì)胞的制備方法大體可分為吸附法、包埋法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法、多孔物質(zhì)包絡(luò)法、超過濾法等幾大類。其中以包埋法使用最為普遍，有使用聚丙烯酰胺凝膠、海藻酸鈣凝膠、卡拉膠、瓊脂糖膠等的凝膠包埋法和用半通透性聚合物薄膜將細(xì)胞包裹起來，形成微型膠囊的微膠囊法2種。至于采用哪種方法，還須根據(jù)不同細(xì)胞和反應(yīng)類型來選擇。但理想的固定化細(xì)胞的制備方法，應(yīng)該具有如下特點(diǎn)：

1）能夠控制固定化細(xì)胞的大小和孔隙度；

2）固定化所使用的原料應(yīng)該便宜、易得，成本應(yīng)盡量低；

3）固定化方法簡便、易行，過程應(yīng)盡可能溫和，盡量少損傷細(xì)胞；

4）固定化細(xì)胞應(yīng)具有穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在所使用的pH和溫度下，不會被破壞；

5）在反應(yīng)器內(nèi)長時間運(yùn)轉(zhuǎn)過程中，固定化細(xì)胞應(yīng)具有良好的機(jī)械穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性

6）用于制備固定化細(xì)胞的載體，對細(xì)胞應(yīng)該是惰性的，即不損傷細(xì)胞；

7）固定化細(xì)胞應(yīng)該使底物、產(chǎn)物和其他代謝產(chǎn)物能夠自由擴(kuò)散，因?yàn)楫a(chǎn)物和其他代謝產(chǎn)物常常能抑制細(xì)胞的沒反應(yīng)，更需要擴(kuò)散出去；

8）單位體積的固定化細(xì)胞應(yīng)該擁有盡可能多的細(xì)胞，當(dāng)使用固定化活