《Immunity》：Akoya空間單細(xì)胞蛋白組技術(shù)解析艾滋病免疫失調(diào)機(jī)制

《Immunity》：Akoya空間單細(xì)胞蛋白組技術(shù)解析艾滋病免疫失調(diào)機(jī)制艾滋病是一種危害性極大的病毒性傳染病，由人免疫缺陷病毒（HIV）引起。一般來(lái)說(shuō)，HIV病毒在感染黏膜組織靶細(xì)胞后兩周內(nèi)就會(huì)擴(kuò)散到淋巴器官。進(jìn)入發(fā)病期后，HIV病毒主要通過(guò)攻擊CD4+T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致機(jī)體喪失免疫功能。感染組織微環(huán)境的原位解析能夠幫助我們更深入地理解HIV感染如何導(dǎo)致機(jī)體免疫失調(diào)，但傳統(tǒng)手段很難獲得感染組織的高參數(shù)病理結(jié)果，限制了研究的進(jìn)展。近期，斯坦福大學(xué)的GarryNolan教授研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)蛋白-核酸原位成像法實(shí)現(xiàn)了33種生物標(biāo)志物檢測(cè)，建立了多組學(xué)空間表型分析體系，并在《Immunity》雜志上報(bào)道了HIV宿主淋巴組織免疫抑制微環(huán)境形成機(jī)制的研究成果[1]。研究背景艾滋病又叫獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS），于1981年首次發(fā)現(xiàn)，是由于感染HIV病毒導(dǎo)致的CD4+T淋巴細(xì)胞減少為代表特征的免疫衰竭綜合癥[2]。HIV感染后的平均潛伏期為8-10年，患者常于感染后10-15年因并發(fā)各種機(jī)會(huì)性感染或惡性腫瘤而死亡。近二十年來(lái)，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（ART）用于A(yíng)IDS患者的治療取得了很好的效果。ART能完全抑制HIV的復(fù)制，改善免疫功能并大幅降低AIDS的病發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。但是，ART不能根治AIDS，臨床數(shù)據(jù)表明，停藥后病毒總是可以在幾周內(nèi)“卷土重來(lái)”[3]。體內(nèi)HIV難以清除的主要障礙就是在HIV感染的過(guò)程中，病毒能夠潛伏在某個(gè)亞群的細(xì)胞中，形成HIV潛伏病毒庫(kù)(latentreservoir)。在潛伏病毒庫(kù)中，HIV通過(guò)隱藏在被感染細(xì)胞的基因組中逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，等待發(fā)病時(shí)機(jī)的到來(lái)。目前，對(duì)于組織中潛伏病毒庫(kù)的研究手段多限于消化組織并進(jìn)行單細(xì)胞檢測(cè)，再輔以原位雜交（ISH）和免疫組化。這種檢測(cè)手段無(wú)法深入解讀潛伏病毒庫(kù)及周?chē)?xì)胞亞群的原位空間信息，限制了其研究的發(fā)展。這篇題為“Combinedproteinandnucleicacidimagingrevealsvirus-dependentBcellandmacrophageimmunosuppressionoftissuemicroenvironments”的研究中，作者利用Akoya空間單細(xì)胞蛋白組技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了低拷貝數(shù)病毒核酸和多種蛋白標(biāo)志物的原位檢測(cè)，為我們提供了嶄新的研究視角。接下來(lái)我們就跟著作者的思路，從技術(shù)體系搭建和科學(xué)問(wèn)題研究?jī)蓚€(gè)方面來(lái)解讀本文的內(nèi)容。研究過(guò)程作者首先面對(duì)的關(guān)鍵技術(shù)難題就是：如何能在同一張組織切片上同時(shí)檢測(cè)蛋白表位和微弱的病毒核酸（vDNA和vRNA）信號(hào)？研究選用了非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物疾病模型，分別利用猿猴免疫缺陷病毒（SIV）和新冠病毒（SARS-CoV-2）進(jìn)行vDNA和vRNA造模。將核酸原位雜交技術(shù)（DNA/RNAScope）與該課題組常用的幾種蛋白原位檢測(cè)技術(shù)（IF、Akoya的PhenoImagerHT(原VectraPolaris）、Akoya的空間單細(xì)胞蛋白組PhenoCycler（原CODEX)、MIBI）技術(shù)相結(jié)合，在細(xì)胞系（圖1B）和組織切片（圖1D和E）中實(shí)現(xiàn)了蛋白-核酸原位成像（簡(jiǎn)稱(chēng)PANINI）。值得一提的是，在實(shí)驗(yàn)體系優(yōu)化過(guò)程中，作者利用pH9抗原修復(fù)液有效保留樣本ISH敏感性的特點(diǎn)，突破了傳統(tǒng)方法樣本制備的技術(shù)壁壘。成功實(shí)現(xiàn)了一個(gè)樣本中31種蛋白和2種核酸（對(duì)vRNA和vDNA單拷貝級(jí)別精度）的檢測(cè)。圖1

蛋白-核酸原位成像技術(shù)（PANINI）的建立接下來(lái)，作者在超多標(biāo)蛋白-核酸原位成像的基礎(chǔ)上對(duì)樣本進(jìn)行空間表型分析，對(duì)比SIV感染組和對(duì)照組恒河猴淋巴組織中的細(xì)胞表型差異。33種標(biāo)志物中包含：結(jié)構(gòu)標(biāo)志物（dsDNA，HistoneH3，Pan-Keratin，SMA和Vimentin），核內(nèi)功能標(biāo)志物（FoxO1，F(xiàn)oxP3，Ki-67，LaminAC，NF-κB-p100和Pax-5），細(xì)胞質(zhì)內(nèi)標(biāo)志物（IL-10，granzymeB和CD25），髓系細(xì)胞功能標(biāo)志物（CD11b，CD16，CD68，CD163和DC-SIGN），免疫細(xì)胞分群標(biāo)志物（CD21、CD36、CD45、CD56、CD138、HLA-DR和MPO），以及標(biāo)記感染細(xì)胞的vDNA和vRNA。根據(jù)免疫細(xì)胞標(biāo)志，作者得到樣本中14種細(xì)胞表型的分析結(jié)果（圖2）。圖2

空間表型識(shí)別結(jié)果在對(duì)14種細(xì)胞亞群逐一分析的過(guò)程中，作者發(fā)現(xiàn)通過(guò)FOV細(xì)胞表型分析無(wú)法歸納出病毒感染之后免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)規(guī)律。該空間單細(xì)胞表型分析出場(chǎng)了！作者的應(yīng)對(duì)策略是采用細(xì)胞鄰域（CellularNeighborhood，CN）分析，不僅關(guān)注細(xì)胞本身，還關(guān)注該細(xì)胞周?chē)?9個(gè)細(xì)胞（共20個(gè)細(xì)胞，圖3A），并對(duì)得到的信息加以k-means聚類(lèi)分析（不考慮感染指標(biāo)，圖3B），進(jìn)而得到了11個(gè)有著獨(dú)特細(xì)胞分布特征的細(xì)胞鄰域（CN，圖3B）。在CN分類(lèi)完成的基礎(chǔ)上，分析SIV感染導(dǎo)致的CN分布改變以及其中細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)。這種細(xì)胞群體追蹤的方法讓作者找到了多個(gè)SIV感染后的微環(huán)境變化規(guī)律。在SIV感染導(dǎo)致的眾多CN變化中，作者發(fā)現(xiàn)病毒感染導(dǎo)致CN8（富含巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞）取代CN3（富含巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞）占據(jù)主導(dǎo)地位，同時(shí)巨噬細(xì)胞免疫抑制功能相關(guān)標(biāo)志物（DC-SIGN，F(xiàn)oxO1，IL-10和CD169）陽(yáng)性的細(xì)胞比例顯著升高。圖3

病毒感染后組織微環(huán)境內(nèi)細(xì)胞鄰域分析接下來(lái)作者做了詳細(xì)的細(xì)胞-細(xì)胞分析以及CN-CN分析，對(duì)比SIV感染后組織重塑情況（圖4），進(jìn)一步將關(guān)注點(diǎn)鎖定在富含B細(xì)胞的CN2和富含巨噬細(xì)胞的CN8上。至此，作者已經(jīng)找出SIV感染事件中導(dǎo)致免疫失調(diào)的關(guān)鍵細(xì)胞：病毒依賴(lài)性B細(xì)胞和免疫抑制型巨噬細(xì)胞（詳細(xì)過(guò)程見(jiàn)原文）。圖4SIV感染后的組織重塑分析在隨后的功能性分析中，作者發(fā)現(xiàn)CN2中的B細(xì)胞和CN8中的巨噬細(xì)胞中IL-10陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著升高（圖5A）。一系列巧妙的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和檢測(cè)結(jié)果表明：SIV感染激活B細(xì)胞中FoxO1的表達(dá)，產(chǎn)生IL-10促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的M2型活化，進(jìn)而形成免疫抑制微環(huán)境。圖5SIV感染后B細(xì)胞來(lái)源IL-10產(chǎn)生與巨噬細(xì)胞極化和免疫抑制相關(guān)最后，作者還用蛋白-核酸原位成像技術(shù)進(jìn)行了SIV病毒感染后組織特性的分析，找出了感染過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵的標(biāo)志物（CD56，IL-10，F(xiàn)oxO1，HLA-DR，CD21等）并提出了相應(yīng)的原位多組學(xué)空間表型分析模型。不得不承認(rèn)，這篇文章可謂是空間表型分析在艾滋病研究中應(yīng)用的杰出典范。Akoya空間單細(xì)胞蛋白組學(xué)PhenoCycler華盈生物提供服務(wù)的Akoya空間單細(xì)胞蛋白組學(xué)PhenoCycle（原CODEX）技術(shù)平臺(tái)，采用專(zhuān)利的DNA偶聯(lián)抗體檢測(cè)技術(shù)結(jié)合自動(dòng)化高分辨熒光顯微鏡，可還原蛋白質(zhì)和特定細(xì)胞在組織中的真實(shí)分布?？蓪?shí)現(xiàn)近百種蛋白質(zhì)的空間原位檢測(cè)。技術(shù)優(yōu)勢(shì)：●分辨率高，精確到0.251μm?！裣啾菼MC，可實(shí)現(xiàn)全片掃描，無(wú)需預(yù)先限定感興趣區(qū)域（ROI）?！?gt;70種已驗(yàn)證的DNA偶聯(lián)抗體可供自由選擇組合。●定制化更加靈活，可與商品化panel聯(lián)合使用。相關(guān)文獻(xiàn)1.JiangS,ChanCN,XRovira-Clavé,etal.Combinedproteinandnucleicacidimagingrevealsvirus-dependentBcellandmacrophageimmunosuppressionoftissuemicroenvironments.2022,Immunity55,1118–11342.JUNPOHiv/Aids.2006ReportontheGlobalAIDSEpidemic.GenevaSwitzerlandUnaidsJun,2004,27(7):553-556.3.Deeks,S.,Overbaugh,J.,Phillips,A.etal.HIVinfection.2015,NatRevDisPrimers1,15035.該文章轉(zhuǎn)自：AkoyaBio微信公眾號(hào)|業(yè)務(wù)咨詢(xún)：400-869-2936微信同號(hào)）|工作郵箱：market@|官網(wǎng)鏈接：關(guān)于華盈上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“華盈生物”）成立于2012年，位于上海閔行區(qū)綠洲環(huán)路396弄5幢4層，是一家集產(chǎn)品研發(fā)—技術(shù)服務(wù)為一體的醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域的特色高科技企業(yè)。華盈生物作為專(zhuān)業(yè)的蛋白組學(xué)技術(shù)服務(wù)公司，充分利用核心團(tuán)隊(duì)的科學(xué)背景與資源優(yōu)勢(shì)，成功打造了“蛋白芯片”和“蛋白質(zhì)譜”雙平臺(tái)技術(shù)服務(wù)體系，形成1+1>2的獨(dú)特業(yè)務(wù)優(yōu)勢(shì)。經(jīng)過(guò)多年的穩(wěn)步發(fā)展，華盈生物在業(yè)界逐漸樹(shù)立了“科學(xué)家服務(wù)科學(xué)家”的良好口碑和形象，業(yè)務(wù)覆蓋“蛋白芯片”、“蛋白質(zhì)譜”、“外泌體研究