生物選修1：5.2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段

專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷★分子生物學(xué)研究中最強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一★其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過(guò)程美國(guó)科學(xué)家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎(jiǎng)㈠.DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:一.基礎(chǔ)知識(shí)脫氧核苷酸磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥(niǎo)嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5'3'3'5'多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖3.多脫氧核苷酸鏈的形成5'5'3'3''4.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)⑴.DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。⑵.

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。⑶.兩條鏈上的堿基通過(guò)

連結(jié)起來(lái)，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與

配對(duì)，

一定同胞嘧啶配對(duì)。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥(niǎo)嘌呤㈢.PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）2.DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。3.DNA聚合酶作用過(guò)程當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開(kāi)始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。1.定義：是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。復(fù)制從3，端開(kāi)始延伸合成方向5，端向3，端參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（復(fù)制的起點(diǎn)）胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系打開(kāi)DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈（形成磷酸二酯鍵）使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸PCR引物是人工合成的DNA單鏈，不需解旋酶解旋

細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和PCR不同點(diǎn)?細(xì)胞內(nèi)復(fù)制引物是RNA，需解旋酶解旋4.PCR原理⑴.在80－100°C的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱為變性。⑵.當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈。（復(fù)性）⑶.PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。高溫解決了打開(kāi)雙鏈的問(wèn)題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問(wèn)題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問(wèn)題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化。5.TaqDNA聚合酶的應(yīng)用6.需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)緩沖液（調(diào)節(jié)酸堿度維持PH不變）、DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時(shí)通過(guò)控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。ATTCCGTAAGGCCCCGGGGGGCCC3，端5，端3，端5，端TAAGGCCCCGGG引物Ⅰ引物Ⅱ5，端5，端3，端3，端7.PCR技術(shù)的特點(diǎn)：PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出。8.PCR的重要應(yīng)用：廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定等。⑴.變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。⑵.復(fù)性（退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。⑶.延伸(72℃)DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈。靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：高溫變性靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸靶序列靶序列第1個(gè)PCR循環(huán)完成后：得到兩個(gè)靶序列循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,82430次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量1、PCR儀㈠.設(shè)備及用具實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。二.PCR的實(shí)驗(yàn)操作2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。1.準(zhǔn)備2.移液㈡.實(shí)驗(yàn)操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上。用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑。混合后蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。3.混合⑴過(guò)程：將微量離心管放在離心機(jī)上,離心約10s。4.離心⑵離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果。將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。5.反應(yīng)循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94℃，10min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟──變性、復(fù)性和延伸.PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時(shí)要注意做到：6.注意事項(xiàng)⑴隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；⑵分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭㈠.理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算三.課題成果評(píng)價(jià)1.一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2.a條DNA，復(fù)制n次，DNA為a×2n㈡.實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1.原理可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。2.過(guò)程⑴.稀釋2uL

PCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋.⑵.對(duì)照調(diào)零以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值⑶.計(jì)算⑷.計(jì)算DNA含量(g)＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)50：1g/ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02光吸收波長(zhǎng)／nm2602402202800.10.2比色杯四.課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出特點(diǎn)五.實(shí)驗(yàn)小結(jié)PCR儀加熱使（）變性,復(fù)性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（）為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。如