絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備

絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備第1頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月項目三絲氨酸羥甲基轉移酶的電泳制備第2頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月第1組第2組第3組第4組第5組第6組第7組第8組一、匯報交流方案第3頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月二、討論確定方案SDS制備SHMTSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）是一種在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中加入SDS和巰基乙醇，以消除蛋白質分子所帶的凈電荷和形狀對電泳遷移率影響的電泳技術。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中待檢蛋白質的遷移率主要依賴于其相對分子質量，因此被廣泛用于測定蛋白質的相對分子質量。第4頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月十二烷基硫酸鈉是一種陰離子去污劑，與蛋白質結合可形成蛋白質-SDS復合物，由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質-SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原來的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別。第5頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月在聚丙烯酰胺凝膠電泳體系中加入SDS和巰基乙醇，能掩蓋不同蛋白質間的電荷差異，并引起蛋白質構象變化，從而導致變性后的蛋白質分子在凝膠電泳中的遷移率取決于其相對分子質量大小，而與其他因素（原有電荷、形狀）無關。通過這種電泳方式可將細胞中所有蛋白質根據(jù)各自的相對分子質量大小而分離開來。第6頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳方向混合樣品電泳帶孔膠大分子小分子第7頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月SHMT的電泳制備操作流程安裝電泳槽剝膠電泳上樣制膠染色第8頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月三、關鍵操作試劑配制制膠剝膠第9頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月四、方案實施清潔領取物料操作填寫生產(chǎn)記錄清場與清潔第10頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月SHMT的電泳制備安裝電泳槽剝膠電泳上樣制膠染色第11頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月材料：大腸桿菌培養(yǎng)物懸液（含SHMT）器材：（1）夾心式垂直板電泳槽；（2）直流穩(wěn)壓電源（電泳儀）；（3）培養(yǎng)皿及竹夾子；（4）長針頭（8~10cm）及普通針頭；（5）注射器（10ml）；（6）微量進樣器（50μl）；（7）細長皮頭吸管；（8）移液管架；（9）棕色試劑瓶；（10）白色試劑瓶；（11）1ml、2ml、5ml吸量管；（12）卷紙1包；（13）大平皿，（14）移液槍（配20μl槍頭）。（一）材料與儀器第12頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月夾心垂直板電泳槽示意圖1：導線接頭2：下貯槽3：凹形橡膠框4：梳子5：固定螺絲6：上貯槽7：冷凝管凝膠模示意圖1：梳子2：長玻璃板3：短玻璃板4：凹形橡膠框第13頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）試劑及配制（1）30%丙烯酰胺儲存液稱取丙烯酰胺29g、甲叉雙丙烯酰胺1g，加熱至37℃溶解，蒸餾水定容至100mL，裝于棕色瓶，4℃保存。（2）1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）緩沖液稱取Tris18.17g，加蒸餾水溶解，濃鹽酸調pH至8.8，定容至100mL。（3）1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）緩沖液稱取Tris12.12g，加蒸餾水溶解，濃鹽酸調pH至6.8，定容至100mL。第15頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）10%SDS溶液稱取SDS10.0g，加蒸餾水，68℃助溶，定容至100mL。（5）10%過硫酸銨溶液稱取1.0g過硫酸銨，加水定容至10mL，4℃保存。（6）5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（pH8.3）稱取Tris15.1g、甘氨酸94g、SDS5g，加水定容至1L，室溫存放，使用時稀釋5倍使用。第16頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月（7）考馬斯亮藍R250染色液在45mL甲醇、45mL水和10mL冰乙酸的混合液中溶解0.25g考馬斯亮藍R250，用濾紙過濾染液以去除顆粒狀物質。配制500mL。（8）脫色液75mL冰乙酸，50mL甲醇，875mL水，混勻即可。（9）2×SDS凝膠加樣緩沖液配5mL：取1mol/LTris-HCl（pH6.8）0.5mL，SDS0.2g，溴酚蘭10mg，甘油1mL，加水定容至5mL，與樣本混勻前加0.16gDTT。使用時與樣本l∶1（v/v）混勻。第17頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月（10）樣品處理大腸桿菌培養(yǎng)物懸液→離心（3000r/min，5min）→蒸餾水懸浮細胞→加2×SDS加樣緩沖液（1:1）→沸水加熱10min→離心（5000r/min，10min）→取上清液加樣。第18頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）操作步驟（1）將長、短玻璃板分別插到凹形橡膠框的凹形槽中。溫馨提示：注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。（2）在長玻璃板下端與橡膠?？蚪唤绲目p隙處加入已融化的1%瓊脂，封住空隙。溫馨提示：封底用的瓊脂應用1×TBE溶解，凝固后的瓊脂中應避免有氣泡。（3）將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應面對上貯槽。（4）將下貯槽的螺孔對準已裝好螺絲釘?shù)纳腺A槽，旋緊螺絲帽，豎直電泳槽。溫馨提示：安裝電泳槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽，以免緩沖液滲漏。1.電泳槽組裝第19頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）操作步驟2.膠體的制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍

凝膠濃度（%）線性分離范圍（kD）1512～431016～687.536～945.057～212第20頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）分離膠的制備

SDS%分離膠配方

溶液成分不同體積（mL）凝膠液中各成分所需體積（mL）510152025304050蒸餾水1.63.34.96.68.29.913.216.530%丙烯酰胺溶液2.04.06.08.010.012.016.020.01.5mol/LTris（pH8.8）1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過硫酸銨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02按表配制12%分離膠，混勻后迅速將配好的分離膠倒入凝膠模長、短玻璃板間的間隙內，高度約8cm。然后沿長玻璃板板壁緩慢注入少許蒸餾水，進行水封。待凝膠完全聚合（約30min），傾去水封層的蒸餾水，并用濾紙條吸去殘余水分。溫馨提示：若凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。第21頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）濃縮膠的制備

SDS%濃縮膠配方

按配制5%濃縮膠，混勻后迅速加到已聚合的分離膠上方（高度以插入梳子不溢出為宜），輕輕將梳子插入濃縮膠內，待凝膠完全聚合（約30min）后小心拔去梳子。溫馨提示：丙稀酰胺為神經(jīng)毒劑，使用時要小心，操作務必戴手套。過硫酸銨需新鮮配制，并注意濃度，否則影響膠凝固。殘余膠液可暫時留存，便于參考膠凝固時間。溶液成分不同體積（mL）凝膠液中各成分所需體積（mL）123456810蒸餾水0.681.42.12.73.44.15.56.830%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.831.01.31.71.0mol/LTris（pH6.8）0.130.250.380.50.630.751.01.2510%SDS0.010.020.030.040.050.060.080.110%過硫酸銨0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01第22頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月3．上樣

（1）將Tris-甘氨酸電泳緩沖液倒入上、下貯槽中，高度應沒過短玻璃板約0.5cm。（2）用微量注射器吸取10～20μL樣品液加入上樣孔，加樣體積可根據(jù)凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握。溫馨提示：若樣品槽中有氣泡，可用注射器針頭挑除；加樣時，微量注射器針頭應盡量接近加樣槽底部，但針頭勿碰破凹形槽膠面。（三）操作步驟第23頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月4．電泳連接電泳儀，打開電源，按8V/cm確定所需電壓，待指示劑（溴酚藍）進入分離膠后將電壓提高到15V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部（約3h），停止電泳，關閉電源。溫馨提示：正極應接下槽。（三）操作步驟第24頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月5．剝膠電泳結束后，取下凝膠模，卸下橡膠框，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，切角作記號。溫馨提示：剝離凝膠應戴手套，防止污染膠面。（三）操作步驟第25頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月6．染色經(jīng)SDS分離的蛋白質樣品可用考馬斯亮藍R250染色。（1）染色將凝膠浸泡在染色液中，在室溫下緩慢搖動染色30min。（2）脫色回收染色液，凝膠先用蒸餾水漂洗一次，再浸入脫色液中，放在脫色搖床上于室溫平緩搖動3～5h，其間更換脫色液3～4次，直至條帶清晰。（3）漂洗脫色后，用蒸餾水漂洗凝膠3～5次。（三）操作步驟第26頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月五、結果展示與評價SDS-PAGE電泳示意圖1：對照2：樣品M：蛋白質Marker12M第27頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月1、SHMT2、電泳3、電泳技術4、PAGE5、SDS6、IFE六、總結與拓展第28頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月1、SHMTSerinehydroxymethyltransferase絲氨酸羥甲基轉移酶glyA第29頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月2、電泳電泳是指帶電粒子在電場中的運動。帶電粒子（帶電顆粒）在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳(electrophoresis)。第30頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月3、電泳技術利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術稱為電泳技術。利用電泳現(xiàn)象使物質分離的技術稱為電泳技術。不同物質由于所帶電荷、分子大小和形狀不同，在電場中的移動速度不同。

第31頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月4、PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis

聚丙烯酰胺凝膠電泳

以聚丙烯酰胺凝膠為支持介質的電泳技術廣泛用于蛋白質、酶、核酸等生物大分子的分離、制備及定性、定量分析。第32頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑的作用下聚合而成。丙烯酰胺單體和N，N'-甲叉雙丙烯酰胺單獨存在或混合存在時是穩(wěn)定的，當遇到自由基時，二者發(fā)生聚合反應形成三維網(wǎng)狀結構的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的聚合體系有化學聚合和光聚合兩種。第33頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月聚合方式催化劑加速劑聚合條件凝膠特點化學聚合過硫酸銨（AP）N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺（TEMED）堿性環(huán)境膠孔徑較小，多用于制備分離膠光聚合核黃素（VB2）無光膠孔徑較大，不穩(wěn)定多用于制備濃縮膠第34頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點

①在一定濃度時，膠體透明，有彈性，機械性能好。②化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應。③對pH和溫度變化較穩(wěn)定。④幾乎無電滲作用，只要丙烯酰胺單體純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好。⑤樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g。⑥凝膠孔徑可調節(jié)，根據(jù)被分離物質的相對分子質量，改變單體及交聯(lián)劑的濃度可調節(jié)凝膠的孔徑。⑦分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體，因而有更高的分辨率。

第35頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠濃度和交聯(lián)度是影響聚丙烯酰胺凝膠性能的主要因素。通常用100mL凝膠溶液中含有Acr及Bis的總克數(shù)表示凝膠濃度（T%）。交聯(lián)度（C%）是指交聯(lián)劑Bis占單體Acr與Bis總量的百分數(shù)。一般分離蛋白質和核酸的聚丙烯酰胺凝膠標準濃度分別為7.5%和2