免疫組化、免疫熒光、流式細胞術的應用比較及常見問題分析

免疫組化、免疫熒光、流式細胞術的應用(yìngyòng)比較及常見問題分析宋硯明第一頁，共三十五頁。免疫組化（IHC）的應用介紹(jièshào)免疫熒光（IF）的應用介紹流式細胞術（FC）的應用介紹IHC、IF、FC區(qū)別與聯(lián)系第二頁，共三十五頁。整理課件免疫組織化學原理及特點利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理和特殊的標記技術，通過化學反應使標記抗體顯色，對組織細胞內(nèi)的特異性抗原進行定位、定性、定量檢測(jiǎncè)的一門技術。免疫組化具有操作簡單，特異性強，敏感性高，定位準確，形態(tài)與功能相結(jié)合等特點。免疫(miǎnyì)組織化學

（Immunohistochemistry,IHC）

第三頁，共三十五頁。整理課件細胞抗原(kàngyuán)一抗二抗辣根過氧化物(ɡuòyǎnɡhuàwù)酶（HRP）3，3-二氨聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑棕褐色(hèsè)絡合物IHC反應原理示意圖第四頁，共三十五頁。整理課件組織切片/芯片(xīnpiàn)制作第五頁，共三十五頁。整理課件2.組織芯片應用領域組織芯片的應用(yìngyòng)領域包括與生命科學相關的基礎研究、臨床研究、應用(yìngyòng)研究和新藥開發(fā)等。免疫組化染色（IHC）；原位雜交（ISH）；熒光原位雜交（FISH）；原位末端標記分析（TUNEL）；原位PCR以及激光捕獲顯微分離系統(tǒng)輔助的cDNA雜交。1.組織芯片組織芯片（或組織微陣列）是將數(shù)十個甚至上千個不同個體的組織標本集成在一張固相載體(zàitǐ)上，組織芯片中含有蛋白，RNA及DAN分子，是一種高通量的研究分析工具。研究者一次可有效利用成百上千份正?；蚣膊顟B(tài)下的組織標本來研究特定基因及其所表達的蛋白質(zhì)與疾病之間的關系。3.Abgent

現(xiàn)有組織切片/芯片產(chǎn)品全套鼠類器官組織切片；全套猴類器官組織切片；人類(rénlèi)常見癌癥組織切片；組織芯片客戶定制服務。組織芯片/切片應用第六頁，共三十五頁。整理課件免疫組化流程(liúchéng)示意圖第七頁，共三十五頁。整理課件2.SP法原理：根據(jù)生物素(Biotin)與鏈霉親和素(Streptavidin)具有強結(jié)合力的原理設計。在一抗（兔源與鼠源）與相應的靶抗原結(jié)合后，生物素化標記的抗多價二抗與一抗特異結(jié)合；二抗上標記的生物素與標記了辣根過氧化物酶（HRP）的鏈霉親和素結(jié)合，形成(xíngchéng)抗原～特異性一抗～生物素化的二抗～HRP標記的鏈霉親和素復合物。特點：該法孵育時間短（通常為10min），靈敏度高以及低背景染色等特點。1.SABC法原理：SABC法是利用鏈酶親和素(Streptavidin)與生物素(Biotin)特有的高度親和力這一生物學性質(zhì)，先將生物素與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合，形成生物素化HRP，然后與鏈酶親和素按一定比例(bǐlì)混合，形成SABC復合物。用生物素化二抗與第一抗體結(jié)合，再與SABC復合物聯(lián)結(jié)形成抗原～抗體～生物素化二抗～SABC復合物。最后用底物顯色劑顯色。特點：該法具有靈敏度高以及低背景染色等特點。3.Polymer酶標二抗法原理：該法采用一段多聚氨基酸聚合物做為載體鏈，將該多聚物與二抗結(jié)合，然后可再標記上多個HRP/AP酶分子，所以(suǒyǐ)同樣具有很高的信號放大作用。特點：靈敏度高；操作步驟簡單；無需進行內(nèi)源性的生物素封閉。IHC二抗原理及選擇4.直接酶標二抗法該法是將HRP/AP酶分子直接標記于二抗上。因此需要普通的酶標二抗即可完成。實驗簡單，成本低，但是因為沒有信號放大作用，所以對很多表達豐度不是很高的抗原就可能檢測不到。第八頁，共三十五頁。整理課件IHC常用(chánɡyònɡ)酶標二抗原理示意圖第九頁，共三十五頁。整理課件2.AEC顯色法產(chǎn)品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(kāzuò)(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC)是過氧化物酶(Peroxidase)的顯色底物，在過氧化物酶的催化下，AEC顯色工作液會于反應部位產(chǎn)生溶于酒精的紅色沉淀，必須在水溶性介質(zhì)中復染和封片。本試劑盒適用于辣根過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)的免疫組化顯色，包括AEC顯色原和與之配套的稀釋液。試劑盒組成：AEC顯色原（試劑A）AEC底物緩沖液（試劑B）1.DAB顯色法產(chǎn)品描述：二氨基聯(lián)苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)

是過氧化物酶(Peroxidase)的顯色底物，在過氧化物酶的催化下，DAB顯色工作液會于反應部位產(chǎn)生不溶于酒精的棕褐色沉淀。本試劑盒適用于辣根過氧化物酶（HRP）系統(tǒng)(xìtǒng)的免疫組化顯色。試劑盒組成：DAB顯色原（20×）（試劑A）DAB底物緩沖液（1×）（試劑B）3.BCIP/NBT顯色法產(chǎn)品描述：BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍四唑）是一種冷藏穩(wěn)定的、單一組分溶液(róngyè)，用于免疫組化、原位雜交、westernblot、northernblot和southernblot，特異性地與堿性磷酸酶（AP）反應生成紫色物質(zhì)。試劑盒組成：有機溶劑中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮藍四唑IHC顯色方法原理及選擇4.BCIP/INT顯色法產(chǎn)品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/p-碘硝基四唑）是一種冷藏穩(wěn)定的、單一組分溶液，用于免疫組化、原位雜交、westernblot、northernblot和southernblot，特異性地與堿性磷酸酶反應生成橙色/棕褐色物質(zhì)。

試劑盒組成：有機溶劑中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和p-碘硝基四唑第十頁，共三十五頁。整理課件免疫組織化學結(jié)果(jiēguǒ)分析第十一頁，共三十五頁。整理課件2.非特異性顯色石蠟切片脫蠟不徹底，建議延長脫蠟時間。操作過程中沖洗不充分，建議增加沖洗的次數(shù)(cìshù)與沖洗時間。組織富含內(nèi)源性的生物素與過氧化物酶，建議使用相關試劑進行封閉。發(fā)生抗原異位。蛋白封閉不充分，建議增加蛋白封閉時間。1.顯色過深一抗?jié)舛?nóngdù)過高或孵育時間過長，建議降低一抗?jié)舛?nóngdù)或減少孵育時間。孵育溫度過高，建議室溫或4℃孵育。HRP標記二抗孵育時間過長，建議縮短時間。3.顯色強度弱一抗?jié)舛冗^低或孵育時間(shíjiān)過短，建議增加一抗?jié)舛然蜓娱L孵育時間(shíjiān)。試劑超過保質(zhì)期，建議實驗前確認試劑的保質(zhì)期。操作過程沖洗過度，建議適度沖洗。免疫組織化學常見問題分析4.無染色組織中無目的抗原的表達。一抗種屬來源與二抗不匹配，建議實驗前確認一抗的種屬來源。顯色物質(zhì)與HRP系統(tǒng)不匹配，建議實驗前確認顯色體系。第十二頁，共三十五頁。整理課件免疫熒光原理及特點免疫熒光就是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理及特殊的熒光素標記技術，通過激光激發(fā)使熒光素發(fā)出熒光，在熒光顯微鏡下觀察熒光的變化從而對細胞內(nèi)的抗原進行分析的技術。用免疫熒光顯示(xiǎnshì)和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）技術。免疫熒光具有特異性強、敏感性高、速度快等特點。免疫熒光

（Immunofluorescence,IF）

第十三頁，共三十五頁。整理課件免疫熒光原理(yuánlǐ)示意圖第十四頁，共三十五頁。整理課件免疫熒光實驗(shíyàn)過程

細胞爬片（多聚賴氨酸處理(chǔlǐ)，生長密度70-80%）細胞固定（合適的固定液，如4%甲醛溶液等）細胞膜穿透（TritonX-100等）封閉（3%BSA-PBS等）一抗孵育熒光二抗孵育胞漿/核襯染（鬼筆環(huán)肽/DAPI/PI）封片熒光顯微鏡拍照第十五頁，共三十五頁。整理課件免疫熒光結(jié)果(jiēguǒ)分析第十六頁，共三十五頁。整理課件免疫熒光雙染色(rǎnsè)抗體的選擇直接法：一抗種屬來源無要求標記兩種不同(bùtónɡ)熒光素的一抗。間接法：一抗種屬來源來源不同(bùtónɡ)二抗分別標記不同熒光素。第十七頁，共三十五頁。整理課件細胞核襯染染料：DAPI是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料它可以透過完整的細胞膜，因此以用于活細胞和固定細胞的染色。最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nm，其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。Hoechst33342是一種DNA結(jié)合型熒光染料,可以嵌合到堿基分子中,在紫外激發(fā)(jīfā)光作用下發(fā)出蘭色熒光.能夠透過完整的細胞膜，可用于活細胞染色。碘化丙啶(PI)是一種溴化乙啶的類似物，它在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色。PI-DNA復合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為535nm和615nm。細胞漿襯染染料：鬼筆環(huán)肽（phalloidin）由鬼筆鵝膏真菌（Amanitaphalloides）產(chǎn)生的一種環(huán)肽。可與F肌動蛋白結(jié)合，使F肌動蛋白保持穩(wěn)定。其熒光標記物是鑒定F肌動蛋白的重要試劑。熒光抗體的選擇：綠色熒光素：FITC，Alex488，Dylight488等。紅色熒光素：PE，Alex546等。各種熒光染料原理(yuánlǐ)及選擇第十八頁，共三十五頁。整理課件2.信號弱或無信號無目的蛋白或表達量極少，建議選用表達量高的細胞或組織。細胞通透性差，建議增加通透劑的作用時間或濃度。一抗/二抗?jié)舛忍停ㄗh增大其濃度。二抗選擇錯誤(cuòwù)（種屬不匹配），建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。1.背景過高一抗質(zhì)量不高，建議(jiànyì)使用特異性高、效價高的一抗。一抗/二抗?jié)舛忍?，建議降低一抗/二抗?jié)舛?。封閉不完全，建議增加蛋白封閉時間。洗滌不充分，建議增加沖洗次數(shù)與時間。可通過調(diào)節(jié)熒光顯微鏡的參數(shù)來減低背景。3.熒光猝滅快熒光素本身特性決定，光穩(wěn)定性差，建議選用光穩(wěn)定性好的熒光素二抗。用普通(pǔtōng)的封片劑封片，建議選用防熒光猝滅劑封片。免疫熒光常見問題分析4.細胞有自發(fā)熒光使用了戊二醛固定，建議在固定后熒光染色前進行熒光淬滅，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前檢查自發(fā)熒光。材料本身（如石蠟）有自發(fā)熒光，建議設立陰性對照，通過降低熒光顯微鏡的參數(shù)來消除背景染色。

細胞成分中能夠產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（例如核黃素、細胞色素等）的含量高；培養(yǎng)細胞中死細胞／活細胞比例高；第十九頁，共三十五頁。整理課件流式細胞術定義及原理流式細胞儀（FLOWCYTOMETOR）：

進行流式細胞分析的儀器，是集光電子物理，光電測量，計算機，細胞熒光化學(huàxué)，抗體技術為一體的高科技細胞分析儀。流式細胞術（FLOWCYTOMETRY）:

利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速（每秒可達1000-10000個）的定量分析和分選（純度可達99%以上）的技術。流式細胞術（FlowCytometry,FC）第二十頁，共三十五頁。整理課件細胞抗原(kàngyuán)一抗二抗熒光(yíngguāng)物質(zhì)（FITC,PE等）不同(bùtónɡ)顏色的激發(fā)光FC反應原理示意圖激光源轉(zhuǎn)化為計算機識別數(shù)據(jù)第二十一頁，共三十五頁。整理課件流式細胞儀工作(gōngzuò)原理圖第二十二頁，共三十五頁。整理課件第二十三頁，共三十五頁。整理課件流式細胞術實驗(shíyàn)過程

細胞(xìbāo)懸浮液制備（濃度為1～5×106個/ml）細胞固定（合適的固定液，如4%甲醛溶液等）細胞膜穿透（

冰冷的甲醇等）封閉（3%BSA-PBS等）一抗孵育熒光二抗孵育流式細胞儀分析第二十四頁，共三十五頁。整理課件人外周全(zhōuquán)血細胞雙參數(shù)散點圖直方圖：單參數(shù)(cānshù)分析流式細胞術常見結(jié)果(jiēguǒ)分析第二十五頁，共三十五頁。整理課件散點圖：多參數(shù)(cānshù)分析常用(chánɡyònɡ)細胞表型及意義：（ClusterofDifferentiation,CD）CD3

總T細胞CD4T輔助/誘導細胞亞群CD8T抑制/細胞毒細胞亞群CD19

B細胞抗原LL:CD3-CD4-B細胞(xìbāo)群+細胞毒T細胞亞群LR：CD3+CD4-細胞毒T細胞亞群UR：CD3+CD4+T輔助細胞亞群UL0.70UR24.2LR22.3LL52.80第二十六頁，共三十五頁。整理課件熒光補償(bǔcháng)示原理熒光補償是指修正(xiūzhèng)熒光滲漏的過程，如從探測器出去除匹配熒光以外的任何熒光信號。當采用兩種或兩種以上熒光標記時（如FITC,PE），當攜帶兩種熒光素的細胞受到激光照射激發(fā)時，將發(fā)出兩種不同波長的熒光。然而，熒光染料所發(fā)出的熒光都具有一定的波長范圍（寬發(fā)射譜性質(zhì)），雖然各自的熒光峰值不同，但發(fā)射譜范圍會有一定的重疊。因而就會造成不同通道之間的熒光干擾，對實驗結(jié)果造成影響。第二十七頁，共三十五頁。整理課件熒光(yíngguāng)補償示意圖第二十八頁，共三十五頁。整理課件AnnexinV-FITC/PI凋亡(diāowánɡ)檢測原理在細胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。AnnexinV是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸PS高親和力特異性結(jié)合。將AnnexinV進行熒光素（FITC、PE）或Biotin標記，以標記了的AnnexinV-FITC作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在細胞凋亡中晚期的細胞和死細胞，碘化丙啶PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以(kěyǐ)將細胞凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。第二十九頁，共三十五頁。整理課件圖片(túpiàn)引自

第三十頁，共三十五頁。整理課件AnnexinV-FITC/PI凋亡(diāowánɡ)檢測結(jié)果分析第三十一頁，共三十五頁。整理課件熒光強度/背景過高一抗/二抗?jié)舛忍?，建議降低一抗/二抗?jié)舛?。封閉不完全(wánquán)