細胞工程胚胎工程

關(guān)于細胞工程胚胎工程第1頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三一、概述胚胎工程廣義的胚胎工程：或叫胚胎技術(shù),是生物工程的一個分支，是動物生物工程的主干。它是以胚胎移植為基礎(chǔ)，以轉(zhuǎn)基因、細胞融合、干細胞技術(shù)為中心，通過人工操作胚胎，定向改變動物性狀使之為人類造福的一系列生物技術(shù)的總稱。狹義的胚胎工程：俗稱“借腹懷胎”，是指于著床前自一母體（供體）收集胚胎，移植到另一母體（受體）內(nèi)完成妊娠的過程。在畜牧業(yè)上，供體一般為優(yōu)秀母畜，而受體一般為品質(zhì)較差些的母畜。胚胎工程的操作對象：生殖細胞，受精卵及早期胚胎細胞第2頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三二、胚胎發(fā)育的基本過程和機制高等動物的胚胎發(fā)育包括受精、卵裂、囊胚、原腸胚、中胚層及體腔形成、胚層分化等主要階段。低等動物因進化地位不同，其胚胎發(fā)育則缺少相應(yīng)的后幾個階段。第3頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三（一）胚胎發(fā)育的基本過程1.生殖細胞的發(fā)生2.受精3.早期胚胎發(fā)育過程第4頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三哺乳動物的生殖是一個相當復(fù)雜的生命現(xiàn)象，在胚胎早期，生殖細胞首先與體細胞分離，形成的細胞為原生殖細胞(primordialgermcell，PGCs)：卵原細胞（oogonia）和精原細胞（spermtoginia）其后，經(jīng)過性別決定和將要進行的性別分化，形成兩種生殖細胞。

1.生殖細胞的發(fā)生第5頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三卵子的發(fā)生（oogenesis）：卵子的發(fā)育過程中，二倍體的卵原細胞(oogonia)在卵巢內(nèi)進行幾次有絲分裂后，進入減數(shù)分裂。進入減數(shù)分裂后，初級卵母細胞停留在第一次減數(shù)分裂的前期，不再增殖，因此胚胎這個時期的卵母細胞數(shù)目就是一個雌性哺乳動物一生所擁有的全部卵細胞總數(shù)。第6頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三哺乳動物以及其他的許多脊椎動物的卵細胞發(fā)育在出生后停止數(shù)月（鼠）或數(shù)年（人類），直到雌性動物發(fā)育到性成熟才繼續(xù)發(fā)育。青春期之后，卵母細胞進一步發(fā)育，在體積上增加約1000倍，減數(shù)分裂繼續(xù)進行。哺乳動物減數(shù)分裂進行至第二次減數(shù)分裂中期后再一次發(fā)生暫停，直至受精后才完成減數(shù)分裂。第7頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三哺乳動物卵子發(fā)生的模式

第8頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三精子發(fā)生（spermatogenesis）:胚胎睪丸內(nèi)產(chǎn)生精子的生殖細胞在胚胎期不進行減數(shù)分裂，而是停留在有絲分裂細胞周期的早期階段，稱為精原細胞（spermatoginia），出生后繼續(xù)進行有絲分裂。動物性成熟后，這些精原細胞形成精母細胞。每個精母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成4個單倍體的精細胞，通過成熟過程形成4個精子。精子終生都可產(chǎn)生，體積較小，一般具有頭部、頸部和尾部，能運動。第9頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三精子的結(jié)構(gòu)第10頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三Thestagesofoogenesisandspermatogenesis

第11頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三2.受精精子的成熟與獲能(2)卵子的成熟與排放(3)頂體反應(yīng)(4)多精受精的阻斷(5)卵子的激活第12頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三(1)精子的成熟與獲能哺乳動物的精子離開精巢后并沒有受精能力，必須要經(jīng)過成熟和獲能才能使卵子受精。精子的成熟：精子在附睪中成熟。在附睪中多種物質(zhì)的作用下，精子質(zhì)膜的脂類、糖蛋白、唾液酸、吸收抗原、表面ATP等許多成分發(fā)生了變化，負電荷增加，與凝集素的結(jié)合力也發(fā)生改變。第13頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三精子的獲能：精子在生殖道中停留一段時間后才具備受精能力，這一現(xiàn)象稱為精子的獲能（capacitation）。精子的獲能過程是多時期、多步驟的復(fù)雜變化過程，一般認為獲能的第一階段是脫出精子表面的抗原物質(zhì)和去能因子（decapacitationfactors,DF），增強了膜通透性。第二階段是精子細胞膜蛋白發(fā)生變化，即發(fā)生頂體反應(yīng)。精子在體外也能完成獲能（卵泡液、輸卵管分泌物、血清、房水等）。pH、Ca2+等環(huán)境條件對獲能也有影響。

精子在獲能過程中發(fā)生一系列的形態(tài)及生理生化的變化，呼吸明顯加強，運動形態(tài)和速度也發(fā)生很大變化，有直線前進變?yōu)榍€運動。第14頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三精子的行進：在正常生殖過程中，精子在陰道和子宮內(nèi)的運動速度很快，十幾分鐘即達到輸卵管，積聚在輸卵管峽部下2－3cm處，在此停留十幾到幾十個小時，然后繼續(xù)上行，只有少數(shù)精子可以達到輸卵管壺腹部，在此與剛排出的卵相遇，完成受精過程。第15頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三（2）卵子的成熟與排放卵母細胞的發(fā)育與卵泡細胞關(guān)系密切，卵母細胞與卵泡細胞構(gòu)成卵泡（又稱濾泡，follicles），根據(jù)其發(fā)育程度可分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡等。原始卵泡由一個初級卵母細胞和一層扁平的卵泡細胞構(gòu)成，位于卵巢皮質(zhì)的淺層。初級卵泡的初級卵母細胞已經(jīng)增大，由單層和多卵泡細胞構(gòu)成。次級卵泡的卵泡細胞數(shù)量和層數(shù)增加，卵泡體積增大，在卵泡細胞間出現(xiàn)腔隙，這些腔隙逐漸合并，不斷擴大，形成一個較大的卵泡腔。第16頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三

排卵ovulation：隨著卵泡的增大，逐漸向卵巢表面突出，在膠原酶和透明質(zhì)酸酶作用下，卵泡破裂，卵細胞、透明帶和放射冠隨卵泡液一起排出，經(jīng)腹膜腔進入輸卵管的過程。在排卵前，初級卵母細胞完成第一次減數(shù)分裂，形成一個較大的次級卵母細胞和一個很小的第一極體。次級卵母細胞立即進行第二次減數(shù)分裂，但停止于分裂中期，若24h內(nèi)不能受精，就會退化。若24h能受精，它會很快完成第二次減數(shù)分裂，形成一個成熟的卵細胞和一個第二極體。第17頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三（3）頂體反應(yīng)頂體(acrosome)：精子頭的頂端特化的小泡，它是由高爾基體小泡發(fā)育而來。頂體含有各種水解酶類，包括酸性磷酸酶、蛋白水解酶、透明質(zhì)酸酶等，實際上，頂體是一種特化的溶酶體。頂體反應(yīng)：是受精作用的反應(yīng)之一，受鈣離子的調(diào)節(jié)。反應(yīng)過程較長，包括頂體受體的激活、頂體膜與精細胞質(zhì)膜融合、頂體中水解酶的釋放、卵細胞外被（透明帶）的水解等，最終導(dǎo)致精細胞質(zhì)膜與卵細胞質(zhì)膜的融合。

第18頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三（4）多精受精的阻斷多精受精阻斷（blocktothepolyspermy）:精子穿入激活了的卵細胞內(nèi)的一種阻斷機制，阻止另外的精子再進入卵內(nèi)。一旦第一個精子與卵細胞質(zhì)膜融合，多精受精阻斷的主要機制立刻會發(fā)揮作用。重要性：多個精子細胞核進入卵內(nèi)，就會有多余的染色體和中心體，最終導(dǎo)致不正常的發(fā)育。第19頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三阻止多精受精的機制——卵膜的變化精子與卵細胞質(zhì)膜融合后，會引起鈣流的變化，激發(fā)卵質(zhì)膜下皮層顆粒（皮層顆粒是卵內(nèi)一種特殊的、由膜包圍的一種分泌顆粒,它位于質(zhì)膜之下

）的釋放。皮層反應(yīng)起到阻止多精受精的結(jié)果。第20頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三（5）卵子的激活受精時，卵子被激活，組織與減數(shù)分裂某一階段的卵細胞重新啟動，使減數(shù)分裂得以完成，精卵原核融合形成合子。同時也使受精卵發(fā)生一系列的變化，如蛋白質(zhì)的合成增加、細胞開始分裂。作用機理：自由鈣離子的突然增加在這一過程中起到重要的作用。鈣離子波能夠激活依賴鈣調(diào)蛋白的蛋白激酶Ⅱ，此酶的活化導(dǎo)致卵細胞中周期蛋白(成熟促進因子MPF的組分之一)的降解，使其得以完成減數(shù)分裂。第21頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三3.早期胚胎發(fā)育過程卵裂cleavage：受精卵不生長而連續(xù)分裂，形成無數(shù)小細胞，叫分裂球blastomere。由于不同動物卵細胞內(nèi)卵黃多少及其在卵內(nèi)分布情況的不同，卵裂方式不同。桑葚胚：動物早期胚胎發(fā)育的一個階段，受精卵經(jīng)過多次分裂，成為由數(shù)十至數(shù)百個細胞組成的形如桑椹的實心胚胎。例如，哺乳動物的受精卵在受精72h,分裂為12-16個細胞，形成桑葚胚。囊胚blastula：卵裂最終形成球形的中空球形胚，囊胚中間的腔稱為囊胚（blastocoel），

囊胚壁的細胞層稱為囊胚層（blastoderm）。第22頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三胚泡：在哺乳類發(fā)生早期，稱卵裂期終了的胚胎為胚泡。哺乳類的卵進行完全卵裂而形成卵裂球的團塊，不久在團塊內(nèi)部生出空腔，逐漸擴大，最后成為由一層細胞圍成的泡狀體，并從壁的一側(cè)有一細胞團塊向內(nèi)腔突出，這樣的泡狀體就是胚泡。胚泡由三部分構(gòu)成即①滋養(yǎng)層（trophoblast）②胚泡腔(blastocoele)③內(nèi)細胞群(innercellmass)。

胚泡吸收子宮的營養(yǎng)迅速增大，從一直包圍的透明帶中釋放出來，開始逐漸陷入

子宮內(nèi)膜，稱為植入（implantation）或著床（imbed）第23頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三原腸胚gastrula

：囊胚進一步發(fā)育進入原腸胚形成階段，此時胚胎分化出內(nèi)，外兩胚層和原腸腔。其形成方式在各類動物中不同，包括內(nèi)陷、內(nèi)移、分層、內(nèi)轉(zhuǎn)外包。

中胚層及體腔的形成：絕大多數(shù)多細胞動物除了內(nèi)、外胚層之外，在內(nèi)外胚層之間還進一步發(fā)育，形成中胚層（mesoderm）。在中胚層胚層的分化：動物體的組織器官都是從內(nèi)、中、外三個胚層發(fā)育分化而來的。第24頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三（二）胚胎發(fā)育的基本機制1.細胞分化2.細胞分化3.模式形成4.形態(tài)發(fā)生5.生長發(fā)育通常包括5種主要的機制：第25頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三細胞分裂：細胞分裂是胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)，模式建立、形態(tài)發(fā)生、細胞分化及生長都是通過細胞分裂過程完成的。2.細胞分化：細胞分化是發(fā)育的中心問題。胚胎通過細胞分化在結(jié)構(gòu)和功能上出現(xiàn)差異。這種差異來自基因的差異表達、細胞的行為。外界信號和環(huán)境可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生分化。細胞的分化命運是在不同的時間決定的，且決定的程度早期的胚胎細胞較晚期的小。3.模式形成、形態(tài)發(fā)生以及生長第26頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三三、體外受精體外受精（invitrofertilization,IVF），亦稱試管動物技術(shù)，是指把動物的卵子和精子取出在試管內(nèi)混合，受精而形成胚胎的過程。體外受精胚胎一般在體外發(fā)育到一定時期后移植到受體雌性動物輸卵管或子宮內(nèi)，妊娠到產(chǎn)仔?；驹恚菏侨斯つM體內(nèi)環(huán)境，包括營養(yǎng)、溫度、濕度、氣體,滲透壓、pH等，使卵丘卵母細胞復(fù)合體中的初級卵母細胞成熟，同時使精子獲能，完成受精。第27頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三體外受精的研究歷史：1951年，張明覺和Austin同時發(fā)現(xiàn)哺乳動物精子獲能現(xiàn)象。1959年，張明覺從交配12h的母兔子宮沖取精子，從另外2只超數(shù)排卵處理的母兔輸卵管中收集卵子，在體外配置的溶液中完成受精過程。將正常卵裂36枚胚胎移植到6只受體兔輸卵管中，4只懷孕，產(chǎn)下15只健康子兔。這是世界上首批試管動物，標志著體外受精技術(shù)的建立。20世紀80年代中期，發(fā)展迅速。試管小鼠（Whittingham1968年）,大鼠（Toyoda，1974年），嬰兒（Steptoe,1978年），牛（Brackett，1982、年），山羊（Hamda，1985年），綿羊（Hanada，1985年），豬（Chang，1986年）相繼出生。英國學者Edward和Steptoe最早開展了人類體外受精和胚胎技術(shù)的研究，將體外受精后發(fā)育到8細胞期的人早期胚胎移植到母親子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育。在1978年7月26日誕生了世界第一例“試管嬰兒”。第28頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三美籍生物學家張明覺張明覺博士是美國著名生物學家，美國科學院院士，由于在口服避孕藥和人工體外受精的科學研究中取得開拓性的顯著成就而被人們譽為“試管嬰兒的先驅(qū)”、“避孕藥之父”。1908年出生,1933年他畢業(yè)于清華大學1938年，張明覺赴英國愛丁堡大學農(nóng)學系留學，次年轉(zhuǎn)入劍橋大學學習，主攻動物育種和人工授精。1941年，他獲得生物學博士學位。1945年，張明覺移居美國，在麻省渥斯特生物實驗研究所進行卵子移殖的研究，先后擔任副研究員、高級研究員兼首席科學家，爾后他又兼任波士頓大學教授，并加入了美國籍。第29頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三體外受精技術(shù)：

1.卵母細胞的采集和體外培養(yǎng)

2.精子的獲能

3.體外受精

4.受精卵的體外培養(yǎng)

5.胚胎移植第30頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三卵細胞的采集和成熟培養(yǎng)（1）卵細胞的采集

1）超數(shù)排卵：利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個過程就稱為超數(shù)排卵（superovulation）。通過從輸卵管中沖取的方式獲得成熟的卵子。

2）從活體卵巢中采集卵母細胞：借助超聲波探測儀、內(nèi)鏡或腹腔鏡直接從活體動物的卵巢中吸取卵細胞。3）從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細胞：從剛屠宰的母畜體內(nèi)摘出卵巢，無菌條件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直徑卵泡中的卵母細胞。第31頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三（2）卵母細胞的選擇和成熟培養(yǎng)采卵獲得的卵母細胞絕大部分與卵丘細胞形成卵丘卵母細胞復(fù)合體（cumulusoocytecomplesx）,根據(jù)卵母細胞的形態(tài)規(guī)則，細胞質(zhì)均勻程度及外圍卵丘細胞包圍情況，挑選A,B級卵母細胞，洗滌后，在成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)。觀察出現(xiàn)放射冠后，備用。超數(shù)排卵采集的卵母細胞已經(jīng)在體內(nèi)發(fā)育成熟，因而不需培養(yǎng)可直接與精子受精。第32頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三2.精子的獲能處理

獲能有體內(nèi)和體外方法：

?體內(nèi)獲能是從交配的母畜子宮內(nèi)沖取精子用于受精。

?體外獲能分兩步：精子洗滌除去雜質(zhì)、死精子、低活力精子、凍精保護液及稀釋液，然后使用高離子強度液，鈣離子載體，肝素等促使鈣離子進入精子頂體，刺激精子內(nèi)部pH升高，誘發(fā)精子獲能。第33頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三3.體外受精將獲能的精子和成熟的卵子置于受精液中共同培養(yǎng)，使之完成受精過程。為了提高體外受精的成功率，可以借助顯微操作儀將精子直接注入卵母細胞質(zhì)（ICSI）或透明帶(SUZI)下，完成受精過程。顯微受精技術(shù)避免了由透明帶或卵質(zhì)膜所形成的受精障礙，使受精率和準確率大大提高。第34頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三4.受精卵的體外培養(yǎng)受精卵需要在培養(yǎng)液或輸卵管中發(fā)育到桑葚胚或囊胚階段，移植到受體后才能獲得較高的妊娠率。發(fā)育阻滯：在化學組分確定的培養(yǎng)基中，早期胚胎往往不能完成從受精卵到囊胚的發(fā)育全過程,而停頓在某個特定的發(fā)育時期.這種現(xiàn)象被稱為“發(fā)育阻滯”?？朔l(fā)育阻滯的方法：1.改進培養(yǎng)液的成分，改善培養(yǎng)條件，滿足發(fā)育所需物質(zhì)，去除不利成分。

2.利用體細胞共同培養(yǎng)體系，提供發(fā)育所需物質(zhì)條件。5.胚胎移植第35頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三體外受精的意義及用途：1.可用于研究哺乳動物的配子發(fā)生、受精、和胚胎早期發(fā)育機制。

2.治療人類男性和雄性動物的生殖不育

2.在充分利用優(yōu)良品種資源、縮短家畜繁殖周期、加快品種改良速度方面有重要價值。

3.是哺乳動物胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成部分?？傊?，體外受精技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學、醫(yī)學、畜產(chǎn)學、實驗動物學等各個領(lǐng)域。

第36頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三體外受精存在的問題：1.效率有待提高2.體外培養(yǎng)體系有待完善3.基礎(chǔ)理論研究有待加強第37頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三四、胚胎移植技術(shù)胚胎移植（embryotransfer)：俗稱“借腹懷胎”，“借劣質(zhì)動物之腹懷優(yōu)秀個體之胎”。

將良種母畜（供體）配種后的早期胚胎，移植到另外一頭與供體生理狀態(tài)相同的母畜（受體）體內(nèi)，這個來自供體的胚胎能夠在受體的子宮著床，并繼續(xù)生長和發(fā)育，最后產(chǎn)下供體的后代。供體一般為優(yōu)秀母畜，而受體一般為品質(zhì)較差些的母畜。第38頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第40頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三羊“媽媽”帶著沒有一點血緣關(guān)系的羊“孩子”在曬太陽。

第41頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三（一）胚胎移植的生理學基礎(chǔ)

?成年母畜卵巢上存在數(shù)千到上萬個卵泡，在外源激素作用下，每個發(fā)情期的卵泡發(fā)育和排卵數(shù)可達數(shù)十個

?每個發(fā)情周期生殖器官都有一個孕向發(fā)育

?早期胚胎處于游離狀態(tài)

?胚胎發(fā)育不存在免疫問題

?胚胎發(fā)育到一定階段會與子宮發(fā)生生理和組織聯(lián)系?胚胎的遺傳性不受受體的影響第42頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三供體和受體在分類學上的相同屬性動物生理上的一致性：受體和供體在發(fā)情時間上的同期性胚胎的質(zhì)量：胚胎必須是正常的，并在處理過程中不受不良因素的影響（二）胚胎移植的基本原則第43頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三（三）胚胎移植的技術(shù)程序供體應(yīng)具有相當高的育種價值供體生殖機能應(yīng)處于較高的狀態(tài)：產(chǎn)后60天以上，無生殖系統(tǒng)疾病，體質(zhì)強健受體應(yīng)容易購買，繁殖性能好，對地方適應(yīng)性強，體型中上等，非優(yōu)良品種受體健康狀況良好，已進入發(fā)情季節(jié)供受體發(fā)情時間應(yīng)接近或一致1.供體和受體的選擇第44頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三

超數(shù)排卵:利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更

多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出。2.超數(shù)排卵處理意義：讓每個供體提供更多的胚胎

第45頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三3.同步發(fā)情同步發(fā)情又稱同期發(fā)情，是指利用某些激素制劑人為地控制并調(diào)整一群母畜發(fā)情周期的進程，使之在預(yù)訂時間內(nèi)集中發(fā)情。

常用的發(fā)情技術(shù)：a向母畜群同時施用孕激素，抑制卵泡的發(fā)育和發(fā)情，經(jīng)過一定時間同時停藥，隨之引起同期發(fā)情。（原理，施藥期間，外源孕激素代替了內(nèi)源孕激素，形成人為黃體期，推遲了發(fā)情期的到來）

b利用前列腺素使發(fā)情提前到來。

第46頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三必須用優(yōu)秀的種公畜進行多次配種，一般隔8-12小時進行一次配種，直到發(fā)情結(jié)束。配種前應(yīng)對種公畜的精液進行質(zhì)量檢查。也可以采用人工授精的方法，多次輸精。4.供體母畜配種第47頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三5.胚胎采集手術(shù)法收集胚胎

輸卵管沖胚（輸精后3-4d）子宮角沖胚（樹精后5d）

非手術(shù)法收集胚胎二路式?jīng)_卵器應(yīng)用第48頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三6.胚胎的檢查與鑒定檢胚：收集到的沖洗液靜置，移去沖洗液，檢查胚胎數(shù)量，觀察胚胎質(zhì)量。無卵裂現(xiàn)象（未受精）和異常卵（外膜破裂、卵裂球破裂等）都不能用于移