基因工程知識點(diǎn)

名詞說明

1.基因工程：是將目的基因或DNA片段與適合的載體連接轉(zhuǎn)入目標(biāo)生物細(xì)胞，通過復(fù)制、轉(zhuǎn)

錄、翻譯外源目的基因和蛋白質(zhì)的活性表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因生物取得新的遺傳性狀的操作。

2”艮制性內(nèi)切核酸酶：能夠識別雙鏈核A分子中的某一段特東核昔酸序列,并在此切割DNA

雙鏈的內(nèi)切核酸酶。

3.同切點(diǎn)酶：又稱同裂酶，是一類來源于不同微生物、能識別相同DNA序列的限制性內(nèi)切核

酸酶。

4.同尾酶：是一類限制性內(nèi)切核酸酶，它們來源各異，識別的靶序列也各不相同，但切割后

能產(chǎn)生相同的黏性結(jié)尾。

5.酶的星號活性(Staractivity)：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值

等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的酶的星號活性現(xiàn)象。

連接酶：是能催化雙鏈DNA片段靠在一路的3'羥基結(jié)尾與5'端磷酸基團(tuán)結(jié)尾之間通過形

成磷酸二酯鍵，使兩結(jié)尾連接的一種核酸酶。

7.載體：在基因克隆中能攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞復(fù)制、整合或表達(dá)的工具稱為載體。

8.多克隆位點(diǎn)：是包括多種同一個限制性醐切點(diǎn)的一段很短的

9.a互補(bǔ)：為質(zhì)粒DNA編碼B一半乳糖昔酶的a亞基，宿主細(xì)胞可編碼B亞基盡管宿主和質(zhì)

粒編碼的片段各自都沒有酶活性，但它們能夠融為一體，形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)，這種

互補(bǔ)現(xiàn)象叫a互補(bǔ)。

10.黏粒載體(考斯質(zhì)粒載體)：是一類人工構(gòu)建的含有膜DNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊

類型的載體。

11.質(zhì)粒：是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)固遺傳的一類核

酸分子

12.探針：當(dāng)用一個標(biāo)記的核酸分子與核酸樣品雜交，即可查明該樣品中是不是存在與該標(biāo)記

核酸分子具有同源性的核酸分子。那個標(biāo)記的核酸分子稱為探針(probe),能夠是DNA,也

能夠是RNA,或合成的寡核甘酸.

13、SD序列：是存在于原核生物起始密碼子上游7-12個核甘酸內(nèi)的一種4-7個核甘酸的保

守片段，它與16SrRNA3,端反向互補(bǔ)，因此可將mRNA的AUG起始密碼子置于核糖體的

適當(dāng)位置以便起始翻譯作用。

14、包括體：目的蛋白子啊細(xì)胞質(zhì)的還原性環(huán)境中，以不溶性的形式產(chǎn)生并聚集形成蛋白質(zhì)

聚合物即為包括體。

簡答：

1.阻礙限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素

答：1）DNA的純度

2）DNA的甲基化程度

3）消化反映的緩沖液系統(tǒng)

4）DNA的分子結(jié)構(gòu)

5）酶的純度

6）酶切反映的溫度

7）酶的星號活性

2.大腸桿菌DNA聚合酶I與klenow片段的比較

答：1）結(jié)構(gòu)上的區(qū)別：Klenow片段是完整DNA聚合酶I的一個片段，是用途理大腸桿菌

DNA聚合酶I時，取得的兩個片段中分子量較大的一個，具有5'-3'聚合酶活性和3'T5'

的外切酶活性，不含5'T3'外切酶活性。

2）功能上的區(qū)別:可通過DNA的方式制備。而klenow酶要緊用于缺口平移標(biāo)記DNA,

也用于DNA的缺口補(bǔ)平和延伸。還在頂用于第二條鏈的合成。

3.載體的大體條件

答：1）.具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性），能夠攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞;

2）能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，并實(shí)現(xiàn)外源基因的增殖；

3）.具有多種單一的限制性核酸內(nèi)切酶識別切割位點(diǎn)；

4）.具有較高的外源DNA的載裝能力；

5）.具有適合的挑選標(biāo)記。

4.質(zhì)粒的大體性質(zhì)

答：（1）自主復(fù)制。質(zhì)粒DNA上都含有一個復(fù)制起始區(qū)，操縱著質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,

這一復(fù)制起始區(qū)稱為‘復(fù)制子"。一樣一個質(zhì)粒DNA分子上只含有一個復(fù)制子。按復(fù)制能力

可將質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型和松弛型兩類。

（2）不相容性：在沒有選擇壓力的情形下，兩種親緣關(guān)系緊密的不同質(zhì)粒，不能夠在同

一寄主細(xì)胞系中穩(wěn)固地共存的現(xiàn)象，又稱為不親和性。如此的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。

（3）轉(zhuǎn)移性：能在自然條件下自發(fā)地從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞（接合作用）的質(zhì)粒

稱為接合型質(zhì)粒；不能在自然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用的質(zhì)粒稱為非接合型質(zhì)粒。

（4）編碼性狀：野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主

生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀。

五、Southern雜交（DNA）步驟：

答：①DNA的片段化及其電泳分離；

②凝膠電泳后的變性處置；

③轉(zhuǎn)移并固定到濾膜上；

④雜交；

⑤檢測與分析

六、基因組文庫與cDNA文庫的區(qū)別

基因組文庫：基因組文庫簡稱基因文庫，是將某一生物基因組DNA片段化并全數(shù)克隆

后取得的重組子群體的總稱。

CDNA文庫：是將生物特定的組織器官或特定發(fā)育時期的全數(shù)mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,

并全數(shù)克隆成重組子，在該重組子群集中包括了全數(shù)表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄本。

區(qū)別：基因組文庫包括全數(shù)基因，但cDNA文庫石油mRNA反轉(zhuǎn)錄取得的,，已經(jīng)去掉

基因中的內(nèi)含子部份

7.比較克隆載體與表達(dá)載體的異同

同：1）.具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性），能夠攜帶外源基因進(jìn)入受體

細(xì)胞；

2）能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，并實(shí)現(xiàn)外源基因的增殖；

3）.具有多種單一的限制性核酸內(nèi)切酶識別切割位點(diǎn)；

4）.具有適合的挑選標(biāo)記。

異：1）表達(dá)載體在克隆載體的基礎(chǔ)上又增加了基因表達(dá)的調(diào)控元件：即啟動子一一核

糖體結(jié)合位點(diǎn)一一克隆位點(diǎn)——轉(zhuǎn)錄終止信號（區(qū)分二者的標(biāo)志）

2）克隆載體在菌體中一樣是多拷貝的，而表達(dá)載體一樣是低拷貝的。

八、外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式有哪些？如何純化？

1）包括體蛋白：純化步驟：細(xì)胞搜集與破碎，洗滌與溶解，變性蛋白質(zhì)的純化，重組

蛋白質(zhì)的復(fù)性，天然蛋白質(zhì)的分離。

2）融合蛋白：融合蛋白的提取，重折疊，純化，天然蛋白的回收和蛋白質(zhì)的水解愛惜。

3）分泌型蛋白：第一要進(jìn)行濃縮處置，然后再依照發(fā)酵液中的有效成份和雜質(zhì)之間的

理化性質(zhì)存在的不同來考慮選擇適合的純化方式。如離子互換層析，親和層析，凝膠過濾等。

4）可溶性表達(dá)產(chǎn)物：經(jīng)細(xì)胞破碎后的可溶性離心上清液，可利用若是有可利用的單克

隆抗體或相對特異性的親和配基,，可選用親和層析分離法。對處于極端等電點(diǎn)的蛋白，采

納離子互換層析分離。

5）周質(zhì)表達(dá)蛋白：大腸桿菌細(xì)胞低濃度溶菌酶處置，滲透壓裂解法，周質(zhì)腔分離出目

的蛋白。

九、抑制性消減雜交（SSH）的原理和進(jìn)程

原理：SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR,它是一種將檢測子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減

雜交步驟融為一體的技術(shù)。抑制性PCR是利用鏈內(nèi)復(fù)性優(yōu)先于鏈間復(fù)性的原理，是非目標(biāo)

序列片段兩頭的長反向重復(fù)序列在復(fù)性時產(chǎn)生"鍋柄樣''結(jié)構(gòu)或"發(fā)夾結(jié)構(gòu)''而無法與引物配

對，從而選擇性地抑制了非目標(biāo)序列的擴(kuò)增。

FirstHytondizMion

A

B

SecondHybndization：

non-denatunng.mixsaniples.addfreshdenatureddriver,anneal

A,B,C,D,andE

A.B.C.D,andE

Fillintheends

A?,

B：：：S

cS——5——

□

?UsesuppressionPCR(annealat65℃),onlyEcan

givePCRproducts;

?Usenestedprimerstoenhancespecificity

論述題：

一、PCR技術(shù)的原理、成份、步驟、應(yīng)用及引物設(shè)計的要求

1）原理：PCR技術(shù)是以DNA互補(bǔ)鏈的聚合反映為基礎(chǔ)，通過DNA變性、引物與模板

DNA一側(cè)的互補(bǔ)序列復(fù)性雜交，由DNA聚合酶催化引物延伸，最終取得特異DNA片段的體

外擴(kuò)增方式。

2）成份：模板、引物、DNA聚合酶（耐高溫）、Dntp

3）步驟：①變性：系統(tǒng)加熱至92C-96C,使dsDNA（雙鏈）解鏈成為ssDNA（單鏈），

且熱變性不改變其化學(xué)性質(zhì)；

②退火：降溫至37℃-72℃,使引物與模板的互補(bǔ)區(qū)相結(jié)合；

③延伸：在72℃條件下，DNA聚合酶將dNTP持續(xù)加到引物的3，-0H端，合成

DNA。

4）應(yīng)用：一、引物設(shè)計；二、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析；3、DNA基元查找；4、同源性分

析

5）引物設(shè)計：

①長度：至少16bp,一樣為18-30bp：

②兩個引物之間的Tm最好接近，最好1C之內(nèi)，最多不超過5℃；

③幸免引物內(nèi)部或引物之間存在互補(bǔ)序列；

?G+C含量應(yīng)盡可能操縱在40%至60%之間；

⑤引物3,端的末位堿基對T叫酶的DNA合成效率有較大的阻礙，A的錯配概率較高，應(yīng)盡

可能幸免利用；

⑥引物3,端顯現(xiàn)3個以上的持續(xù)堿基，如GGG或CCC,也會使錯誤引發(fā)機(jī)率增加；

⑦最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計；

⑧引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3,端相似性較高的序列，不然容易致使

錯誤引發(fā)；

⑨的5'端能夠修飾，而3'端不可修飾。

2.基因工程技術(shù)流程

答：1）目的基因克隆

2）載體的預(yù)備

3）目的基因與載體的連接

4）重組DNA轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)

5）體的挑選與鑒定

6）重組體的大量培育，外源基因表達(dá)效應(yīng)分析與開發(fā)應(yīng)用

3、轉(zhuǎn)化率的計算（結(jié)合2回答）

例題：某一DNA重組實(shí)驗的充沛率為20%,轉(zhuǎn)化率為107/mg載體，經(jīng)酶切和連接處置后

的重組載體轉(zhuǎn)化率比天然載體低約100倍,欲取得104個重組克隆，需要投入多少載體DNA

進(jìn)行重組實(shí)驗？

解答：假設(shè)重組率為100%,那么轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個重組克隆需要載體DNA,重組率為20%

時投入載體為，載體投入量確信后，即可按10:1的要求算出5mg。

4、依照同源性設(shè)計引物（pl02?104）/5TIACE擴(kuò)增

1）分析核心區(qū)段

取得某蛋白質(zhì)的氨基酸序列，依照密碼子與氨基酸對應(yīng)關(guān)系，選取兩段持續(xù)的保守氨基酸序

列，寫出其可能的編碼序列，對蛋白質(zhì)同源性或同源性基因cDNA序列進(jìn)行充分的比對，

若是利用的是蛋白質(zhì)序列資料，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中比較與之同源的蛋白序列，找出蛋白質(zhì)保

守性高的區(qū)域，作為引物設(shè)計的位點(diǎn)，若是是利用同源cDNA的資料，從數(shù)據(jù)庫中取得多

個近緣物種同源序列后，進(jìn)行序列多重比較，選擇高保守性區(qū)段序列并設(shè)計引物。

2）設(shè)計簡并引物和擴(kuò)增核心區(qū)段

由于一個氨基酸可對應(yīng)一個到多個密碼子，因此一段氨基酸序列能夠有多個可能的編碼序

列，稱為簡并序列。相應(yīng)合成這一段序列作PCR擴(kuò)增體系的引物即為簡并引物。在選取氨

基酸序列時往往優(yōu)先選取對應(yīng)密碼子較少的殘基，為了降低簡并度,舍棄最后一個氨基酸其

密碼子的第三位堿基。設(shè)計核心區(qū)段擴(kuò)增的簡并引物還要考慮擴(kuò)增區(qū)段的長度和在cDNA

分子中的位置，通常擴(kuò)增序列在幾百堿基內(nèi)成效較好。

3）設(shè)計RACE引物，并進(jìn)行TRACE和TRACE擴(kuò)增

3，RACE依照中間核心序列設(shè)計出3,端RACE的上游引物后，利用dT作為下游引物，利用

mRNA反轉(zhuǎn)錄成的第一鏈cDNA作為模板將CDNA3,端擴(kuò)增出來

5'RACE盡管其下游引物能夠依照克隆的核心序列能夠確信下來，但由于5,端上游序列未

知，上游的引物難以確信，因此5,RACE要采納一些特殊方式確信其上游引物位點(diǎn)。

5.基因工程的平安性問題（主觀題，可兩方面分析）

其他知識點(diǎn)

一、Northern雜交（RNA）;Western雜交（蛋白質(zhì)）

二、核酸分子骨架中的磷酸