生物素親和素系統(tǒng)相關(guān)技術(shù)

關(guān)于生物素親和素系統(tǒng)相關(guān)技術(shù)第1頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三一、生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）一)生物素及活化生物素二)親和素及鏈霉親和素三)生物素-親和素系統(tǒng)的特點第2頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三一）生物素及活化生物素(一)生物素1概念：生物素(biotin)是動、植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶R或維生素H。2.分子式：

C10H16O3N2S分子量：244.31第3頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三3.結(jié)構(gòu)：（CH2）4COOH

結(jié)合親和素結(jié)合蛋白質(zhì)咪唑酮環(huán)噻吩環(huán)第4頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三whywhywhy為什么要對生物素進行活化？為什么要對生物素進行活化？第5頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三我是生物素我可以是抗體，也可以是酶第6頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三我是親和素，我來了第7頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三BrokenHeart第8頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三我是親和素，我來了第9頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三1）生物素分子較小，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，由于大分子蛋白質(zhì)的空間位阻效應，可影響生物素與親和素間的結(jié)合；

2）生物素只能依靠肽鍵與蛋白質(zhì)上的氨基結(jié)合。

因此，活化生物素可克服以上缺點，既減少空間位阻效應，又可擴大其結(jié)合的對象。(二)活化生物素第10頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三生物素與蛋白質(zhì)的結(jié)合第11頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三1.標記蛋白質(zhì)氨基：N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）、長臂活化生物素（BCNHS）。2.標記蛋白質(zhì)醛基：酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）。3.標記蛋白質(zhì)巰基：3-（N-馬來酰亞胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。4.標記核酸：光生物素、生物素脫氧核苷三磷酸、BNHS和BHZ。第12頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三1.標記蛋白質(zhì)氨基：N-羥基丁二酰亞胺酯（BNHS）、長臂活化生物素（BCNHS）?？贵w中性和偏堿性蛋白的標記第13頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三2.標記蛋白質(zhì)醛基：生物素酰肼（BHZ）、肼化生物胞素（BCHZ）用于偏酸性糖蛋白的生物素標記第14頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三標記對象：

大分子活性物質(zhì)：如抗原、抗體。標記后不影響免疫活性。

酶：如HRP、葡萄糖氧化酶和ALP等。會降低ALP的活性。(三)生物素標記蛋白質(zhì)第15頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三活化生物素可與不同的大分子物質(zhì)結(jié)合，應根據(jù)可標記基團的種類及特性，選擇相應的活化生物素；抗體：BNHS

偏酸性抗原：BHZ

核酸：光生物素第16頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三一個蛋白質(zhì)分子可聯(lián)結(jié)多個生物素分子，即生物素化大分子具有多價性，它是BAS多級放大作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。但每個蛋白質(zhì)上標記的生物素分子數(shù)量應控制在一定范圍。每個抗原標記1-3個生物素分子為宜；每個抗體標記3-5個生物素分子為宜；生物素：IgG(mg/mg)=2:1，效果較好。第17頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三一、生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）一)生物素及活化生物素二)親和素及鏈霉親和素三)生物素-親和素系統(tǒng)的特點第18頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三二）親和素和鏈霉親和素(一)親和素(avidin，A)1.概念：是動物微生物中提取的一種含10%碳水化物的堿性糖蛋白。2.分子量：680003.結(jié)構(gòu)：4個相同亞基組成的四聚體糖蛋白，富含色氨酸，它是與生物素結(jié)合的基團。第19頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三A4.特性：每個亞基都可結(jié)合1個生物素分子，即1個親和素分子可結(jié)合4個生物素分子。5.親和常數(shù)：1015/mol6.缺點：由于是堿性蛋白（PI=10），且含糖基，與聚苯乙烯的非特異性吸附較高，會導致本底增大，降低檢測靈敏度。第20頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三二）親和素和鏈霉親和素(二)鏈霉親和素(streptavidin，SA)：1.概念：是從鏈球菌屬的菌培養(yǎng)液中提取的一種蛋白質(zhì)。2.分子量：650003.結(jié)構(gòu)：由4個相同的肽鏈組成，甘氨酸和丙氨酸含量較大。第21頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三4.特性：1個親和素分子可結(jié)合4個生物素分子。5.親和常數(shù)：1018/mol6.優(yōu)點：為弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，因此與聚苯乙稀的非特異性吸附遠低于親和素，因此應用廣泛。SA第22頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三標記對象：大分子物質(zhì)：如酶、抗原和抗體。小分子物質(zhì)：膠體金、FITC和化學發(fā)光物等。二）親和素和鏈霉親和素(三)親和素的標記第23頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三一、生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）一)生物素及活化生物素二)親和素及鏈霉親和素三)生物素-親和素系統(tǒng)的特點第24頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三三）生物素-親和素系統(tǒng)的特點1.特異性強：

親和素和生物素間的高親和力。2.靈敏度高：

每個親和素分子可與四個生物素結(jié)合；生物素化大分子具多價性。3.快速、穩(wěn)定：4.應用廣泛：可與酶、熒光素、膠體金等多類標記技術(shù)結(jié)合；第25頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三

可有Ag與Ab反應的各種免疫方法：夾心法、間接法、競爭法等，在此基礎(chǔ)上引入A-B系統(tǒng)。BAB法：BA法：ABC法：二、BAS的基本類型及原理第26頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三BAB法：

Ab·BAAb·B-AB·?Ab·B-A-B·?

特點：以游離A分別連接B-Ab和B-E；Ab·B和A-B的兩次放大效應，可提高靈敏度。

第27頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三+A+A+BAB法在夾心ELISA中的應用第28頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三BA法：

Ab·BA·?Ab·B-A·?特點：省略加標記生物素步驟，操作較BAB法簡便；Ab·B的放大效應，該法有相當高的靈敏度。第29頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三+A-EBA法在間接ELISA中的應用第30頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三ABC法：⑴A+B·?A-B·?----------ABC⑵Ag+Ab·BAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC

特點：是在BAB法基礎(chǔ)上的改良，將BAB法中的A先與B-E結(jié)合，制備成復合物ABC；操作比BAB法簡便，但仍然保持較高的靈敏度。第31頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三++ABCB-E+AABCABC法在夾心ELISA中的應用第32頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三1、BAS在酶免疫技術(shù)中的應用2、BAS在熒光免疫技術(shù)中的應用3、BAS在放射免疫技術(shù)中的應用4、BAS在分子生物學中的應用三、生物素-親和素系統(tǒng)的應用第33頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三免疫-PCR

免疫PCR是在ELISA的基礎(chǔ)上建立起來的新方法，用PCR擴增代替ELISA的酶催化底物顯色。

PCR具有很強的放大能力，其可以定量地檢測DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特異性，因此，將與抗原結(jié)合的特異抗體通過連接分子與DNA結(jié)合，再經(jīng)PCR擴增，由此定量檢測抗原使敏感性高于ELISA和RIA。

第34頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三免疫-PCR一、主要程序1.抗原+生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復合物；2.加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復合物；3.加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；4.PCR擴增生物素化DNA部分。第35頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火第36頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三PCR技術(shù)具有高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍第37頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三二、免疫PCR的發(fā)展

免疫PCR技術(shù)目前尚處于研究階段，應用的還不多；實驗表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR產(chǎn)生的背景信號很弱，可以檢測到幾百個分子的抗原，在理論上免疫PCR可以檢測到一個分子抗原，因此，免疫PCR特別適用于檢測一些