CBIQ對(duì)肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

CBIQ對(duì)肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

作者：黃穎，張丙芳，招明高，王曉明，黃晨

【摘要】目的：研究CBIQ對(duì)肺泡上皮細(xì)胞株A549氧化損傷的保護(hù)作用.方法：應(yīng)用MTT法檢測不同濃度CBIQ對(duì)正常及過氧化氫損傷的肺泡上皮細(xì)胞株A549的保護(hù)作用；DNALadder檢測細(xì)胞凋亡；相差顯微鏡觀察Hoechst染色后細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化.結(jié)果：H2O2損傷后的A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度CBIQ處理后，細(xì)胞死亡數(shù)明顯減少.濃度為1×10-2，1×10-3mmol/L的CBIQ組平均細(xì)胞存活率分別為(±)%，(±)%，較損傷組(±)%明顯增高()；終濃度為100μmol/LH2O2及10μmol/LCBIQ共同干預(yù)A549細(xì)胞4h后，可檢測到凋亡標(biāo)志性的DNA梯形帶；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯下降().結(jié)論：在一定濃度范圍內(nèi)，CBIQ對(duì)氧化損傷的A549細(xì)胞生長有濃度依賴性的保護(hù)作用，并可抑制氧化損傷的A549細(xì)胞發(fā)生凋亡.

【關(guān)鍵詞】CBIQ；急性病；肺/損傷；肺泡；上皮細(xì)胞

【Abstract】AIM:Toexploretheprotectiveroleof4Chlorobenzo［F］isoquinoline(CBIQ)inoxidativelydamagedhumanlungepithelialcelllineA549.METHODS:AfterculturedwithdifferentdosesofCBIQ,thenormalA549cellsandtheoxidativelydamagedcellswerebothtestedbyMTTassay.CellapoptosiswasdetectedbyDNALadder.CellmorphologicalchangewasobservedbyHoechststainingunderaphasecontrastmicroscope.RESULTS:AfterA549cellsweretreatedwithdifferentconcentrationsofCBIQ,dosedependentprotectionwasdemonstrated.Thecellviabilityrateofthegroupby1×10-2and1×10-3mmol/LCBIQwererespectively(±)%and(±)%，whichwerehighermarkedlythantherateoftheinjurygroup(±)%().Fourhoursafterexposureto100μmol／LH2O2and10μmol/LCBIQ,A549cellsundertooktheapoptosisdisplayedbytheDNALadder.Thepercentageofcellapoptosiswaslowerinexperimentalgroupthanincontrolgroup().CONCLUSION:Inacertainconcentrationrange,CBIQcandosedependentlyprotecthumanlungepithelialcellsfromoxidativelydamage.Theactivatorofcysticfibrosistransmembraneconductanceregulator(CFTR)caninhibittheapoptosisofoxidativelydamagedA549cells.

【Keywords】CBIQ;acutedisease;lung/injuries;pulmonaryalveoli;epithelialcells

0引言

急性肺損傷(acutelunginjury，ALI)是急性呼吸衰竭的重要病因之一.氧化應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的大量氧自由基和H2O2作用于肺部時(shí)可引起肺泡上皮細(xì)胞活性降低，甚至產(chǎn)生ALI.肺泡上皮細(xì)胞Na+，Cl-異?？缒まD(zhuǎn)運(yùn)在肺水腫形成中起重要作用［1］.囊性纖維跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)是肺泡上皮細(xì)胞中一種氯通道蛋白，CFTR異?？山档推鋵?duì)Na+通道的抑制作用，致Na+重吸收增加，加上Cl-分泌減少，易導(dǎo)致肺組織水腫.CBIQ是一種CFTR氯通道特異性開放劑［2-3］，能促進(jìn)CFTR氯通道開放，使Na+向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)增加，提高肺泡的液體清除能力.我們采用A549細(xì)胞作為肺泡上皮細(xì)胞模型，觀察CBIQ對(duì)氧化應(yīng)激引起A549細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，探討CFTR氯通道及CBIQ在ALI發(fā)生發(fā)展中的作用.

1材料和方法

1．1材料

人肺泡上皮細(xì)胞模型A549細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室惠贈(zèng).CBIQ；噻唑藍(lán)(MTT)；DNALadder試劑盒、熒光染料Hoechst33258；新生牛血清(杭州四季青)1640培養(yǎng)液(Gibco公司).

1．2方法

1．2．1噻唑藍(lán)(MTT)比色實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞存活率用含100mL/L熱滅活新生牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞，置37℃，50mL/LCO2及充分飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，隔日換培養(yǎng)液，直至細(xì)胞鋪滿瓶底的70%～80%，用胰蛋白酶消化并傳代，選對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種于2塊96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后開始干預(yù).第1塊板分2組.對(duì)照組：只加培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組：分別加入不同濃度的CBIQ.反復(fù)試驗(yàn)8次.第2塊板分3組：對(duì)照組：只加培養(yǎng)液；損傷組：加入100μmol/LH2O2；實(shí)驗(yàn)組：加入100μmol/LH2O2后再分別加入不同濃度的CBIQ.反復(fù)試驗(yàn)15次.干預(yù)后共孵育24h進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔.與實(shí)驗(yàn)組平行設(shè)只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白對(duì)照孔，比色時(shí)以此孔調(diào)零.酶聯(lián)免疫檢測儀測定不同藥物濃度的A490nm.以每組5個(gè)孔A490nm的平均值作為各組的平均A490nm值.記錄結(jié)果，取數(shù)次結(jié)果的平均值，計(jì)算各組細(xì)胞的存活率：細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A490nm／對(duì)照組A490nm)×100％.

1．2．2DNA梯形帶法檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)共分3組.對(duì)照組：正常細(xì)胞；損傷組：加入100μmol/LH2O2；實(shí)驗(yàn)組：加入100μmol/LH2O2后再加入1×10-5mol/L的CBIQ.細(xì)胞經(jīng)干預(yù)后收獲約1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌2次，加含μL蛋白酶K的裂解液500μL裂解細(xì)胞，50℃水浴過夜；采用苯酚氯仿抽提法，4℃高速離心提取DNA，加60μL醋酸胺和600μL冷無水乙醇-20℃過夜；4℃高速離心10min，700mL/L冷乙醇700μL漂洗沉淀，TE緩沖液60μL溶解DNA.取5μLDNA溶液進(jìn)行18g/L瓊脂糖凝膠電泳，將電泳凝膠置于GelDoe2000凝膠圖像掃描分析系統(tǒng)，掃描圖像.

1．2．3Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn)共分3組.對(duì)照組：正常細(xì)胞；損傷組：加入100μmol/LH2O2；實(shí)驗(yàn)組：加入100μmol/LH2O2后，再加入1×10-5mol/LCBIQ.細(xì)胞干預(yù)前于6孔板中鋪板爬片，每孔約5×104個(gè)細(xì)胞.干預(yù)6h后將玻片取出，40g/L多聚甲醛固定10min，PBS洗滌，Hoechst染色5min，置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核的變化.對(duì)每張細(xì)胞片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，分別計(jì)數(shù)正常細(xì)胞數(shù)(胞膜完整，著均勻藍(lán)色)，凋亡細(xì)胞數(shù)(核染亮藍(lán)色，呈均勻的致密斑塊或分葉狀)，每個(gè)樣品至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡率.取5次結(jié)果的平均值.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12．0進(jìn)行ANOVA方差分析.為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2．1細(xì)胞存活率濃度為1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5mmol/LCBIQ實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均存活率分別為(±)%，(±)%，(±)%，(±)%，(±)%.其中濃度為1×10-1mmol/L組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.H2O2損傷組細(xì)胞存活率為(±)%；濃度為1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5mmol/L的CBIQ實(shí)驗(yàn)組平均細(xì)胞存活率分別為(±)%，(±)%，(±)%，(±)%，(±)%.其中濃度為1×10-2，1×10-3mmol/L組與損傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2．2凋亡的檢測DNA梯形帶檢測結(jié)果顯示A549細(xì)胞染色質(zhì)DNA裂解成180～200bp和其不同倍數(shù)的片段，瓊脂糖凝膠電泳后顯示出凋亡細(xì)胞特有的梯形帶.

2．3凋亡率的測定H2O2損傷組凋亡率為(±)%，鏡下可見細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多，且多為分葉狀.CBIQ實(shí)驗(yàn)組為(±)%，較損傷組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，且多為致密斑塊，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3討論

滲透性肺水腫尤其是肺泡內(nèi)水腫是導(dǎo)致ALI時(shí)低氧血癥的主要病理基礎(chǔ)之一［4］.肺泡上皮細(xì)胞作為ALI主要受損的靶細(xì)胞，具有保持肺泡相對(duì)干燥的屏障功能.在致傷因素作用下，肺泡上皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致液體漏入肺泡腔；肺泡上皮液體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)能受損，肺泡內(nèi)液體清除障礙，造成肺泡性肺水腫［5］.

CFTR氯通道是肺泡上皮細(xì)胞中起最主要作用的一種氯離子通道.Su等［6］發(fā)現(xiàn)CFTR氯通道和質(zhì)子門控鈉通道共同存在于人呼吸道黏膜腺細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞，在損傷肺組織的水鹽轉(zhuǎn)運(yùn)中共同起調(diào)節(jié)作用.對(duì)鼻腔黏膜上皮細(xì)胞及中耳上皮細(xì)胞均有類似研究，CFTR氯通道可抑制Na+重吸收，在鼻炎及中耳炎的液體分泌中有重要意義［7-8］.但在肺泡上皮細(xì)胞水平的研究較少.Gu等［9］通過在體實(shí)驗(yàn)觀察到使用CFTR開放劑NS004可增加肺泡液體清除率，提示可能與Na+轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān).Szkotak等［3］在正常呼吸道上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CBIQ可通過同時(shí)開放細(xì)胞頂膜的CFTR氯通道和基底側(cè)膜的Ca2+敏感K+通道從而增加C1-和K+分泌.理論上，可進(jìn)一步通過質(zhì)子泵的作用使Na+重吸收減弱，水排出增加，由此CBIQ比NS004更具有優(yōu)越性.

我們采用多種檢測細(xì)胞活性及凋亡的方法，從細(xì)胞凋亡的角度觀察到CBIQ對(duì)A549細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用.成功模擬了急性肺損傷細(xì)胞模型，證明了一定濃度的CBIQ可減少細(xì)胞的凋亡.在MTT實(shí)驗(yàn)中，隨著CBIQ濃度增高，細(xì)胞凋亡或死亡不同程度的減少.當(dāng)劑量達(dá)1×10-2mmol/L和1×10-3mmol/L時(shí)，保護(hù)作用更加明顯，表明CBIQ對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用隨濃度增加而增強(qiáng).實(shí)驗(yàn)中觀察到CBIQ可抑制氧化損傷所導(dǎo)致的A549細(xì)胞系的凋亡.DNALadder法檢測到凋亡所具有的典型梯形條帶；Hoechst染色后，倒置顯微鏡下可直接觀察到凋亡細(xì)胞減少.關(guān)于CBIQ是通過影響何種通路來抑制氧化損傷所導(dǎo)致的A549細(xì)胞的凋亡，目前尚未見到相關(guān)報(bào)道，可能與抑制ERK相關(guān)［10］.由此可見，CBIQ可維持氧化損傷細(xì)胞的CFTR氯通道功能的正常，這對(duì)保持肺泡上皮細(xì)胞活性具有重要意義.

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