動物細胞培養(yǎng)的歷史與展望課件

從動物細胞培養(yǎng)到組織工程

施秀惠國立臺灣大學生命科學系嚴重急性呼吸道癥候群

SARS

(severeacuterespiratorysyndrome)病原體究竟是冠狀病毒?副黏液病毒?或其他?臺灣與香港的研究進展有落差!重要關(guān)鍵:是否尋獲有感受性的細胞株?

何謂動物細胞培養(yǎng)？

植物組織培養(yǎng)

(planttissueculture)金線蓮非洲菫生物組成之階層

(Thehierarchyofbiologicalorder)分子

(molecule)細胞(cell)組織(tissue)器官(organ)系統(tǒng)(system)個體(organism)族群(population)群聚(community)生態(tài)系(ecosystem)植物細胞與組織培養(yǎng)動物細胞或動物組織培養(yǎng)通稱的動物組織培養(yǎng)

(ATC-Animaltissueculture)

究竟在培養(yǎng)什麼?蛙胚延髓組織培養(yǎng)在青蛙淋巴凝塊內(nèi)動物細胞培養(yǎng)之創(chuàng)始通稱的動物組織培養(yǎng)培養(yǎng)對象為(動物)細胞層級增殖基礎(chǔ)為有絲分裂,不涉及減數(shù)分裂獲得初級培養(yǎng)(primaryculture)或細胞株(cellline)Clone-株,克隆invitroculture(體外培養(yǎng))vs.invivo(活體)

如何培養(yǎng)動物細胞？

兩種基本策略

初級組織塊培養(yǎng)法(primaryexplantculture)

分散細胞培養(yǎng)法(dispersedcellculture)

草蝦淋巴器官組織塊細胞培養(yǎng)吳郭魚生殖腺單層細胞培養(yǎng)基本設(shè)備無菌操作檯-配備

HEPAfilter倒立顯微鏡倒立顯微鏡和25T培養(yǎng)瓶培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)器材:培養(yǎng)皿、盤、瓶等

培養(yǎng)基:aminoacids,vitamins,coenzymes

添加物:血清、生長激素等

培養(yǎng)條件:氣相、溫度等利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)之

優(yōu)勢和限制

優(yōu)勢

控制下的環(huán)境性質(zhì)已知且均質(zhì)化的標本

經(jīng)濟性限制

經(jīng)驗和技術(shù)之需求度高量產(chǎn)之困難

細胞株之穩(wěn)定性

最嚴峻的挑戰(zhàn)-污染(contamination)

--自始至今皆然污染物的種類與特徵偵測方法與操作原則交叉污染

預防污染方法

消毒(Sterilization)

物理法、化學法、機械法無菌操作(Aseptictechnique)

學習之宗旨與精髓

動物細胞培養(yǎng)技術(shù)之成就與貢獻

病毒學研究

體外(invitro)培養(yǎng)病毒

1937:黃熱病毒

1949:小兒麻痺病毒……..製備疫苗

1954諾貝爾生理醫(yī)學獎:Enders,Weller，Robbins試想:如果開發(fā)出SARS,(禽)流感或

AIDS疫苗?!HPV疫苗-子宮頸癌新剋星HPV-人類乳突病毒,經(jīng)由性行為傳染,引起子宮頸癌HPV16型疫苗之人體試驗(2002/11新英格蘭醫(yī)學雜誌刊登)全美16個醫(yī)學中心,2392位16~23歲女性,同步進行實驗組-1194人,對照組-1198人接種疫苗後追蹤17.4個月結(jié)果:實驗組-無人發(fā)生持續(xù)性HPV感染對照組-9個HPV導致之子宮頸癌前病變遺傳學研究

核型(karyotype)分析

例如:胎兒診斷

羊膜或絨毛膜穿刺

遺傳代謝疾病診斷

其他重要應用基因工程作為基因之增殖與表現(xiàn)系統(tǒng)癌癥研究

基因轉(zhuǎn)殖動物人工生殖

潛力與展望組織工程學

(Tissueengineering)

-2000年5月美國《時代》雜誌列為

未來十大熱門工作之首主要致力於組織和器官的再生與形成在一個模仿組織與器官形狀的材料中種入細胞，使細胞依照模型長成新的組織與器官，以修復人體組織的缺損。前驅(qū):美國麻州總醫(yī)院外科醫(yī)師韋肯逖(JosephVacanti）麻省理工學院化工系教授藍格(RobertLanger）構(gòu)想:結(jié)合醫(yī)學與材料工程的知識背景，研發(fā)製造能修復人體病變組織與器官的零件，以克服器官捐贈來源短缺的困境。組織工程的開始成果1.體外培養(yǎng):1992年在多孔狀結(jié)構(gòu)高分子材料上培養(yǎng)出軟骨細胞，並形成新的軟骨組織。2.活體培養(yǎng):老鼠背上培養(yǎng)出人耳形狀的軟骨。

組織工程三大元件-細胞、支架、訊號

細胞

組織生成↗↖訊號支架

細胞

-組織再生的關(guān)鍵策略:採集少量的自體細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)增殖後，再運用於修復體內(nèi)器官。兩種細胞類型：已分化完全的「成熟細胞」，具有分化成其他細胞能力的「幹細胞」。

幹細胞(stemcell)培養(yǎng)

幹細胞是身體所有組織的前身來源:胚胎-完整潛能(totipotent)或豐富潛能(pluripotent)細胞成體-多重潛能或特定功能(multipotent)

細胞NIH(2000May)完整潛能豐富潛能囊胚期細胞NIH(2000May)骨髓神經(jīng)細胞心肌細胞胰島細胞預期將愈來愈多研究現(xiàn)況與應用目標疾病與受傷之治療

例如:脊髓傷害之癱瘓(大鼠)、帕金森氏癥、阿茲海默癥、糖尿病、黏多糖癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎等器官移植具備無限潛力但受倫理規(guī)範胚胎幹細胞研究規(guī)範

(Science2001)第一級:絕對禁止(法、瑞士、西、冰島、波蘭)第二級:現(xiàn)有細胞株,不得再以受精卵製造新細胞株(美國)第三級:可使用人工流產(chǎn)與人工生殖之多餘胚胎

(日本、加、澳洲、以色列)

我國

2002/2/19公告-

「胚胎幹細胞研究倫理規(guī)範」第四級:可為研究目的製造新胚胎

(大陸、美私人經(jīng)費贊助者)人造血管

-組織工程皮膚成功的前提Acollagenbiopolymer(Blacketal.1998):角質(zhì)細胞真皮纖維母細胞臍靜脈內(nèi)皮細胞coculture→endothelializedskinequivalent(ESE)人工關(guān)節(jié)-軟骨再生1.第一次手術(shù):從病人關(guān)節(jié)軟骨中未受力的部分，取出一片約為葡萄乾大小的健康軟骨組織。2.分離出軟骨細胞並經(jīng)三星期的體外

培養(yǎng)，使細胞數(shù)增加約10～20倍。3.第二次手術(shù):清理軟骨受損的部分，從下方骨頭部位取出一片約與傷口大小相同的骨膜，縫在傷口上方，再將軟骨細胞注射到骨膜下方。結(jié)果:經(jīng)過復健一年後即可恢復