微生物發(fā)酵產(chǎn)酶課件2

第二節(jié)常見產(chǎn)酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction精品文檔用于酶生產(chǎn)的微生物特點(diǎn)酶產(chǎn)量高容易培養(yǎng)和管理產(chǎn)酶穩(wěn)定性好利于酶分離純化安全可靠無毒性篩選、誘變、基因克隆等技術(shù)。并及時(shí)復(fù)壯微生物易于與雜質(zhì)分離、易于與酶分離不對(duì)人體、環(huán)境產(chǎn)生影響；不對(duì)酶的應(yīng)用產(chǎn)生影響精品文檔基本要求：不是致病菌發(fā)酵周期短，產(chǎn)酶量高不易變異退化最好是產(chǎn)生胞外酶的菌種,利于分離。對(duì)醫(yī)藥和食品用酶,還應(yīng)考慮安全性：凡從可食部分或食品加工中傳統(tǒng)使用的微生物生產(chǎn)的酶,安全!由非致病微生物制取的酶，需作短期毒性實(shí)驗(yàn)。非常見微生物制取的酶，需做廣泛的毒性實(shí)驗(yàn)，包括慢性中毒實(shí)驗(yàn)。精品文檔一、細(xì)菌(1)大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)，簡稱為大腸桿菌，是最為著名的原核生物。形態(tài)：短桿或長桿狀，0.5～1.0×1.0～3.0um，革蘭氏陰性，運(yùn)動(dòng)(周毛)或不運(yùn)動(dòng)，無芽孢，一般無莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴(kuò)展，光滑，閃光。Escherich屬菌株和大多數(shù)大腸桿菌是無害，但也有些大腸桿菌是致病的，會(huì)引起腹瀉和尿路感染。精品文檔精品文檔大腸桿菌的名聲主要因它易于在實(shí)驗(yàn)室操作、生長迅速，而且營養(yǎng)要求低。應(yīng)用： 大腸桿菌能作為宿主供大量的細(xì)菌病毒生長繁殖 大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌 工業(yè)上生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等測谷氨酸含量等對(duì)白血病有顯著療效精品文檔(2)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）直狀、近直狀的桿菌，周生或側(cè)生鞭毛，革蘭氏陽性，無莢膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生?？莶菅挎邨U菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。精品文檔二、放線菌具有分枝狀菌絲的單細(xì)胞原核微生物。革蘭氏陽性，菌絲有氣生菌絲和基內(nèi)菌絲之分。常用于酶生產(chǎn)的主要為鏈霉菌。應(yīng)用：主要生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶，還可生產(chǎn)青霉素?；浮⒗w維素酶、堿性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等。精品文檔三、霉菌分類學(xué)上屬于藻狀菌綱，毛霉目，根霉屬。根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培養(yǎng)基上固著，并吸收營養(yǎng)）。分布于土壤、空氣中，常見于淀粉食品上，可引起霉腐變質(zhì)和水果、蔬菜的腐爛。(1)根霉(Rhizopus)精品文檔代表種米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。應(yīng)用

根霉能產(chǎn)生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產(chǎn)這些酶類的菌種。在釀酒工業(yè)上常用做糖化菌。有些根霉還能產(chǎn)生乳酸、延胡索酸等有機(jī)酸。精品文檔(2)曲霉(Aspergillus)分類：多數(shù)屬于子囊菌亞門，少數(shù)屬于半知菌亞門。分布：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質(zhì)，有的可產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素。精品文檔代表種：黑曲霉Asp.Niger、黃曲霉Asp.flavus和米曲霉Asp.oryzae應(yīng)用：是制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。生產(chǎn)有機(jī)酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）。農(nóng)業(yè)上用作生產(chǎn)糖化飼料的菌種。精品文檔四、酵母啤酒酵母：啤酒工業(yè)廣泛應(yīng)用，此外，還可生產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶假絲酵母：生產(chǎn)脂肪酶等精品文檔五、酶的發(fā)酵工藝條件與控制Thefermentationprinciplesanditscontrolofenzymeproduction精品文檔1、培養(yǎng)基各種生物對(duì)營養(yǎng)的需求精品文檔1、選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)2、營養(yǎng)物的濃度及配比合適3、物理、化學(xué)條件適宜4、經(jīng)濟(jì)節(jié)約5、精心設(shè)計(jì)、試驗(yàn)比較培養(yǎng)不同的微生物必須采用不同的培養(yǎng)條件；培養(yǎng)目的不同，原料的選擇和配比不同；不同階段，培養(yǎng)條件也有所差異。培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)原則精品文檔五大要素：碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子、水培養(yǎng)基幾乎是一切對(duì)微生物進(jìn)行研究和利用工作的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（medium）是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。任何培養(yǎng)基都應(yīng)該具備微生物生長所需要五大營養(yǎng)要素！?。【肺臋n構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中碳架碳源可作能源，為生命活動(dòng)提供能量常用碳源：糖類、醇類、脂類、有機(jī)酸、烴類、蛋白質(zhì)及其降解物異養(yǎng)微生物：糖類是最好碳源（葡萄糖最為通用）水是微生物最基本的組成分（７０％—９０％）水是微生物體內(nèi)和體外的溶劑（吸收營養(yǎng)成分和代謝廢物）水是細(xì)胞質(zhì)組分，直接參與各種代謝活動(dòng)調(diào)節(jié)細(xì)胞溫度和保持環(huán)境溫度的穩(wěn)定（比熱高，傳熱快）水碳源選擇合適碳源，以適應(yīng)目的酶的合成調(diào)節(jié)機(jī)制特別注意誘導(dǎo)與阻遏作用！自來水？！超純水？！精品文檔構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物中氮素（不能用作能源）氮源有機(jī)氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏無機(jī)氮源銨鹽、硝酸鹽參與酶的組成、構(gòu)成酶活性基、激活酶活性維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓控制細(xì)胞的氧化還原電位有時(shí)可作某些微生物生長的能源物質(zhì)常用：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物以及含有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等元素的化合物。氮源無機(jī)鹽需要注意合適的碳氮比精品文檔生長因子生長因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物質(zhì)進(jìn)行合成，而必須另外加入少量的生長需求的有機(jī)物質(zhì)。分類：化學(xué)結(jié)構(gòu)分成維生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和類脂成分等四類功能：以輔酶與輔基的形式參與代謝中的酶促反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作為各種生長因子的的需要，麥芽汁、米曲汁等天然培養(yǎng)基中本身含有各種生長因子精品文檔實(shí)驗(yàn)室的常用培養(yǎng)基：細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基）；放線菌：高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；霉菌：查氏合成培養(yǎng)基；例如枯草芽孢桿菌：一般培養(yǎng)：肉湯培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基；自然轉(zhuǎn)化：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；觀察芽孢：生孢子培養(yǎng)基；產(chǎn)蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產(chǎn)酶培養(yǎng)基；精品文檔枯草桿菌BF7658α-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉8%，豆餅粉4%，磷酸氫二鈉

0.8%，硫酸銨0.4%，氯化鈣0.2%，氯化按0.15%（自然pH）?？莶輻U菌AS1.398中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉4%，豆餅粉3%，麩皮3.2%,

糠1%,磷酸氫二鈉0.4%,磷酸二氫鉀0.03%（自然pH）。黑曲霉糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10%，豆餅粉4%，麩皮1%（pH4.4～5.0）。地衣芽孢桿菌2709堿性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5.5%,豆餅4%,磷酸氫二鈉0.4%,磷酸二氫鉀0.03%(pH8.5)。黑曲霉AS3.350酸性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉6%,豆餅粉4%,玉米漿0.6%,氯化鈣0.5%,氯化銨1%,磷酸氫二鈉0.2%(pH5.5)。游動(dòng)放線菌葡萄糖異構(gòu)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜2%，豆餅粉2%，磷酸氫二鈉0。1%，硫酸鎂0。05%(pH7.2)。桔青霉磷酸二酯酶發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%,硫酸鎂0.05%,氯化鈣0.04%,磷酸氫二鈉0.05%,磷酸二氫鉀0.05%(自然pH)。黑曲霉AS3.396果膠酶發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮5%,果膠0.3%,硫酸銨2%,磷酸二氫鉀0.25%,硫酸鎂0.05%,硝酸鈉0.02%,硫酸亞鐵0.001%(自然pH)?？莶輻U菌AS1.398堿性磷酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖0.4%,乳蛋白水解物0.1%,硫酸銨1%,氯化鉀0.1%,氯化鈣0.1mmol/L,氯化鎂1.0mmol/L,磷酸氫二鈉20mol/L(用pH7.4的Tris-HCl緩沖液配制)精品文檔2、發(fā)酵條件及控制發(fā)酵過程中的代謝變化與代謝變化有關(guān)的參數(shù)物理參數(shù)——溫度、壓力、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌功率、溶解氧、其它。化學(xué)參數(shù)——基質(zhì)濃度、pH、酶活力生物參數(shù)——菌體形態(tài)、菌體濃度、其它。精品文檔生化代謝曲線菌體生長階段產(chǎn)酶階段菌體自溶階段精品文檔影響產(chǎn)酶的幾個(gè)重要條件溫度通常在生物學(xué)范圍內(nèi)每升高10℃，生長速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應(yīng)，對(duì)于微生物來說，溫度直接影響其生長和合成酶。培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被合成為菌體細(xì)胞物質(zhì)和酶的生化反應(yīng)是吸熱反應(yīng)；菌體生長時(shí)培養(yǎng)物質(zhì)被大量分解，是放熱反應(yīng)。菌體繁殖旺盛時(shí)，發(fā)酵液必須降溫；發(fā)酵初期相反，需要保溫。精品文檔pH

細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH值與生長最適pH值往往有所不同。細(xì)胞生產(chǎn)某種酶的最適pH值通常接近于該酶催化反應(yīng)的最適pH值。

培養(yǎng)基中C/N比值高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH偏低；C/N比值低，發(fā)酵液傾向中性或堿性，pH偏高。培養(yǎng)基中的糖和脂肪被分解和同化時(shí)的氧化程度直接影響pH。

在酶制劑生產(chǎn)中，控制發(fā)酵液pH的方法通常是調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的原始pH，掌握原料的配比，保持一定的C/N值；或添加緩沖劑使發(fā)酵液具備緩沖能力；調(diào)節(jié)通氣量。精品文檔溶解氧的控制在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，處于不同生長階段的細(xì)胞，其細(xì)胞濃度和細(xì)胞呼吸強(qiáng)度各不相同，致使耗氧速率有很大的差別。因此必須根據(jù)耗氧量的不同，不斷供給適量的溶解氧。細(xì)胞對(duì)溶解氧的需要量與細(xì)胞呼吸強(qiáng)度及細(xì)胞濃度密切相關(guān)，可以用耗氧速率KO2表示KO2=QO2*CC單位細(xì)胞量在單位時(shí)間內(nèi)的耗氧量(mmol)/(h*L)呼吸強(qiáng)度細(xì)胞濃度g干細(xì)胞/L細(xì)胞對(duì)氧的需要量與細(xì)胞的呼級(jí)強(qiáng)度及培養(yǎng)基中細(xì)胞濃度密切相關(guān)，兩者均成正比關(guān)系精品文檔溶解氧的因素?cái)嚢柙黾託庖航咏獾挠行娣e增加湍動(dòng)程度，減少氣泡周圍的液膜厚度液體形成渦流，延長氣泡停留時(shí)間阻止或減少菌絲結(jié)塊通風(fēng)量和空氣流速空氣分布管培養(yǎng)基的物理性質(zhì)發(fā)酵液柱高度精品文檔泡沫泡沫的影響泡沫的存在阻礙二氧化碳的排除，直接影響氧的溶解，進(jìn)而影響微生物的生長繁殖和代謝產(chǎn)物的生成。泡沫層過高會(huì)外溢，浪費(fèi)原料且引起染菌。消泡方法機(jī)械消泡消泡劑消泡（化學(xué)消泡）濕度固體發(fā)酵法生產(chǎn)酶制劑時(shí)，培養(yǎng)基的濕度和發(fā)酵室空氣中的相對(duì)濕度對(duì)微生物菌體的生長繁殖和產(chǎn)酶關(guān)系很大。精品文檔發(fā)酵過程的中間補(bǔ)料補(bǔ)糖補(bǔ)氮補(bǔ)無機(jī)鹽類和產(chǎn)酶促進(jìn)劑補(bǔ)全料和補(bǔ)水精品文檔3、提高酶產(chǎn)量的措施添加誘導(dǎo)物對(duì)于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵過程中的某個(gè)適宜的時(shí)機(jī)，添加適宜的誘導(dǎo)物，可以顯著提高酶的產(chǎn)量。例如，乳糖誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導(dǎo)蔗糖酶的生物合成等。誘導(dǎo)物一般可以分為3類

酶的作用底物酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物作用底物的類似物精品文檔控制阻遏物的濃度阻遏作用根據(jù)機(jī)理不同，可分為：產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。1.產(chǎn)物阻遏作用是由酶催化作用的產(chǎn)物或者代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。2.分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過分解代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)）引起的阻遏作用?？刂谱瓒粑锏臐舛仁墙獬瓒?、提高酶產(chǎn)量的有效措施?？莶輻U菌堿性磷酸酶的生物合成精品文檔為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應(yīng)當(dāng)控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度。采用其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補(bǔ)料、分次流加碳源添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP）對(duì)于受代謝途徑末端產(chǎn)物阻遏的酶，可以通過控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除。精品文檔添加表面活性劑表面活性劑可以與細(xì)胞膜相互作用，增加細(xì)胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。

將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、特里頓(Triton)等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產(chǎn)量增加