小鼠早期胚發(fā)育全程微分干涉差顯微觀察

小鼠早期胚發(fā)育全程微分干涉差顯微觀察【摘要】目的對小鼠早期胚發(fā)育全程進(jìn)行系統(tǒng)的微分干涉差顯微觀察并制成圖譜。方法通過體外受精和體內(nèi)受精方法獲得小鼠卵母細(xì)胞和早期胚胎,利用倒置微分干涉差顯微鏡觀察排卵前卵母細(xì)胞至擴(kuò)展囊胚的早期胚發(fā)育全過程,數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)拍照。結(jié)果記錄排卵前卵母細(xì)胞至擴(kuò)展囊胚的小鼠早期胚發(fā)育全過程,制成微分干涉差顯微圖譜。結(jié)論微分干涉差顯微鏡觀察卵母細(xì)胞和各階段早期胚,立體感強(qiáng)，對比度適當(dāng),可以準(zhǔn)確生動地顯示微細(xì)結(jié)構(gòu),所形成的圖譜可供胚胎培養(yǎng)與操作借鑒。

【關(guān)鍵詞】小鼠;胚胎發(fā)育;微分干涉差顯微術(shù)

ABSTRACT:ObjectiveToobservesystematicallyandsetuptheatlasofthewholedevelopmentalprocessofmousepreimplantationembryonicoocytewithdifferentialinterferencecontrast(DIC)microscopy(DIC).MethodsMouseoocytesandpreimplantationembryoswerederivedfrominvitroorinvivofertilization.ThefulldevelopmentalstagesfrompreovulatoryoocytetoexpandedblastocystofmouseembryoswereobservedbyinvertedDICmicroscope,andphotosweretakenbydigitalmicrophotography.ResultsADICatlasofpreimplantationembryosinfulldevelopmentalstageswasformedfrompreovulatoryoocytetoexpandedblastocyst.ConclusionDICtechniqueofferedastereoandfineimageofcell/embryoindifferentstages.Theatlasmadefromthisobservationcanbeusedforreferencetothosewhoneedstocultureandmanipulatemouseembryos.

KEYWORDS:mice;embryonicdevelopment;differentialintereferenceconstrastmicroscopy

隨著功能基因組學(xué)時代的到來,轉(zhuǎn)基因小鼠、基因打靶(尤其是其中的基因敲除)小鼠、克隆小鼠技術(shù)和小鼠胚胎干細(xì)胞工程等,已經(jīng)成為生命科學(xué)各前沿領(lǐng)域普遍采用的研究手段。在這些研究中,使用微分干涉差顯微鏡(differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC)技術(shù)，對小鼠的早期胚進(jìn)行細(xì)致的觀察與操作是不可或缺的關(guān)鍵步驟［1］。筆者對小鼠體內(nèi)發(fā)育或體外受精形成的早期胚各個階段,用DIC顯微鏡進(jìn)行系統(tǒng)觀察并實(shí)時攝影,形成小鼠早期胚發(fā)育全過程圖譜,為推廣小鼠胚胎操作技術(shù),促進(jìn)基因功能研究提供實(shí)用的基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

材料

動物

SPF級ICR小鼠,3周齡雌鼠,體質(zhì)量15~18g;性成熟雌鼠、雄鼠,體質(zhì)量30~35g［上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司,許可證號:SCXK(滬)2003-0003］,雌鼠52只,雄鼠12只。

主要試劑

孕馬血清,麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠);M2培養(yǎng)基、M16培養(yǎng)基:參照文獻(xiàn)［1］配制;KSOM＋AA培養(yǎng)基［2］(EmbryoMax,美國Chemicon公司);礦物油(EmbryoCultureTested,M-8410,美國Sigma公司)。

主要儀器

倒置顯微操作系統(tǒng)(TE-2000U型,日本Nikon公司);數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)(DP-70型,日本Olympus公司);三氣培養(yǎng)箱(3131型,美國Thermo公司);體視顯微鏡(SZX7型,日本Olympus公司);雙人單面凈化工作臺(SW-CJ-1Cu型,蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

方法

小鼠超數(shù)排卵

選用3周或性成熟ICR雌鼠為供卵/胚鼠。用于體外受精的小鼠于第1天17-18時腹腔注射PMSGIU,48h后腹腔注射hCGIU,待用;用于體內(nèi)受精的ICR雌鼠于第1天12時左右腹腔注射PMSGIU,48h后腹腔注射hCGIU,熄燈(20時)前與性成熟雄鼠合籠,自然交配,第4天8時左右檢查雌鼠,選有陰道栓者待用。

排卵前卵母細(xì)胞采集與處理

選取經(jīng)超數(shù)排卵后而未受精的雌鼠,斷頸處死,從腰背部打開腹腔,取出卵巢,在M2培養(yǎng)液中用解剖針刺破卵巢上突出的卵泡,釋放卵泡內(nèi)的卵丘團(tuán),用20μL移液器吹吸,洗凈組織碎片;收集卵丘團(tuán),用自制的玻璃微吸管(D≈120~160μm)反復(fù)吹吸,去除卵丘顆粒細(xì)胞;置于體積分?jǐn)?shù)為的CO2、37℃預(yù)平衡的KSOM液滴中,覆蓋石蠟油,立即觀察。

體內(nèi)受精小鼠早期胚采集與培養(yǎng)

于第4天10時左右(合籠交配d)采集體內(nèi)受精的受精卵。選取超數(shù)排卵并合籠后有陰道栓的雌鼠,斷頸處死,打開腹腔,取出輸卵管和卵巢,剔除血管和脂肪,在M2培養(yǎng)液中刺穿輸卵管壺腹部,挑出卵丘團(tuán),以%透明質(zhì)酸酶消解卵丘細(xì)胞,M2洗滌3遍以上,將卵子分成兩份:一份直接進(jìn)行DIC觀察;另一份轉(zhuǎn)移至預(yù)平衡的KSOM中培養(yǎng)(CO2、溫度條件同)。

體內(nèi)受精小鼠桑椹胚和囊胚采集與培養(yǎng)

于第4天10時前選取超數(shù)排卵并合籠后有陰道栓的雌鼠,做好標(biāo)記,繼續(xù)飼養(yǎng);第7天10時左右(合籠交配d)采集體內(nèi)受精的桑椹胚和囊胚。小鼠斷頸處死,打開腹腔,取出子宮和輸卵管,用裝有M2培養(yǎng)液的1mL注射器刺穿子宮與輸卵管結(jié)合部,沖出子宮內(nèi)的早期胚,M2洗滌3遍以上,轉(zhuǎn)移于預(yù)平衡的KSOM中培養(yǎng)(CO2、溫度條件同)。

體外受精和早期胚培養(yǎng)

第4天8~9時在培養(yǎng)皿中做啞鈴型M16液滴~1mL,覆蓋石蠟油,體積分?jǐn)?shù)為的CO2平衡≥15min;將性成熟雄鼠附睪尾(剔除血管與脂肪)剪碎,放入液滴一側(cè),體積分?jǐn)?shù)為的CO2、37℃培養(yǎng)5~10min;從啞鈴型液滴另一側(cè)吸出運(yùn)動良好的精子懸液適量,調(diào)節(jié)精子密度為(5~10)×105/mL,置于培養(yǎng)皿中形成50~100μL小滴,覆蓋石蠟油獲能培養(yǎng)1~2h(CO2、溫度條件同)。

第4天10時左右,將經(jīng)超數(shù)排卵的雌鼠斷頸處死,打開腹腔,取出輸卵管和卵巢,剔除血管和脂肪,在M2培養(yǎng)液中刺穿輸卵管腹壺部,挑出卵丘團(tuán)(方法同)。吸取卵丘團(tuán)在M16液滴中清洗兩次,加入到精子懸液小滴中,體積分?jǐn)?shù)為的CO2、37℃授精培養(yǎng);于授精培養(yǎng)的不同時間將卵子吸出,觀察精卵相互作用情況;擬作早期胚培養(yǎng)者于授精培養(yǎng)5~6h后,將卵子吸出在M16液滴中洗滌掉多余的卵丘細(xì)胞和精子,并將受精卵分成兩份:一份直接觀察受精結(jié)果;另一份移入KSOM液滴中進(jìn)行早期胚培養(yǎng)(CO2、溫度條件同)。

微分干涉差顯微觀察

用口吸管將卵子或胚胎移入玻璃培養(yǎng)板上,石蠟油覆蓋液滴,置于倒置DIC顯微鏡下觀察。4×物鏡尋找目標(biāo),20×或40×物鏡觀察;調(diào)節(jié)起偏器、檢偏器、光圈和聚光器高度至恰當(dāng)位置,觀察圖像呈灰色調(diào)、圖像浮雕感和反差適中為度。采用數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)進(jìn)行攝影,所有照片均于20×物鏡下拍照。

精子與透明帶的相互作用在體外受精實(shí)驗(yàn)進(jìn)行授精培養(yǎng)2h左右,在倒置顯微鏡下檢查，見卵丘顆粒細(xì)胞完全散開,透明帶暴露明顯時即將卵子吸出,吹吸數(shù)次，除去粘附精子，以4%甲醛固定至精子制動后置于DIC顯微鏡觀察;體外受精結(jié)果的檢查,從移入KSOM時,即授精培養(yǎng)6h(hCG后23~24h)起觀察單細(xì)胞受精卵;排卵前卵母細(xì)胞或體內(nèi)受精的早期胚,從解剖獲取細(xì)胞/胚胎起觀察,此后于連續(xù)實(shí)驗(yàn)過程的每天上午、下午和晚上各觀察1~2次,每次30~90min,記錄觀察/拍照時間并分別計(jì)算圖像距hCG注射或受精的時程。

2結(jié)果

DIC顯微鏡觀察卵母細(xì)胞和各階段早期胚,見細(xì)胞形態(tài)呈浮雕狀的立體圖像,各種結(jié)構(gòu)邊界清晰、細(xì)節(jié)明顯,對比度適當(dāng),可以準(zhǔn)確生動地顯示如細(xì)胞與細(xì)胞核的邊界、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器顆粒、細(xì)胞核內(nèi)的核仁、染色質(zhì)顆粒等微細(xì)結(jié)構(gòu)。

本研究分8個階段連續(xù)觀察早期胚形成與發(fā)育的全過程,包括:(1)排卵前卵母細(xì)胞；(2)排卵后卵母細(xì)胞；(3)受精；(4)受精卵；(5)二細(xì)胞胚；(6)四細(xì)胞胚；(7)八細(xì)胞-桑椹胚；(8)囊胚。每個階段分別觀察≥50個目標(biāo),選取有代表性的各階段細(xì)胞/胚胎攝影圖像并依據(jù)時間次序排列，構(gòu)成圖譜。卵母細(xì)胞和各階段胚胎形態(tài)的DIC顯微圖譜見圖1。依照從卵母細(xì)胞成熟至囊胚擴(kuò)展的次序,對卵母細(xì)胞成熟和早期胚發(fā)育全過程的形態(tài)特點(diǎn)概要描述如下。

小鼠卵巢排卵前卵泡中挑取的未成熟卵母細(xì)胞,可見卵母細(xì)胞肥大,緊貼透明帶,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿細(xì)小的顆粒狀物質(zhì)(簡稱胞質(zhì)顆粒);細(xì)胞核(生發(fā)泡)大而圓,核膜邊緣清晰,核內(nèi)可見核仁及多個染色質(zhì)顆粒［圖1-(1~3)］;部分卵母細(xì)胞的生發(fā)泡轉(zhuǎn)移靠近細(xì)胞表面,胞質(zhì)顆粒變粗并呈聚集狀態(tài),提示細(xì)胞骨架發(fā)生重組［圖1-(3)］。圖1-(4~6)為排卵前的成熟卵母細(xì)胞,［圖1-(4)］示生發(fā)泡破裂,胞質(zhì)顆粒進(jìn)一步增粗;部分卵母細(xì)胞胞質(zhì)局部呈山丘狀突出［圖1-(5)］,并排出形成第一極體,胞質(zhì)顆?；謴?fù)為細(xì)小狀態(tài)［圖1-(6)］。排卵后從輸卵管壺腹部挑取的卵母細(xì)胞與排卵前的成熟卵母細(xì)胞在形態(tài)上并無顯著差別［圖1-(7~8)］,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)緊靠極體或附近區(qū)域可見紡錘體［圖1-(7~8)］,紡錘體處胞質(zhì)顆粒極少或缺乏。體外受精時,大量精子附著于透明帶上,可見卵母細(xì)胞因甲醛固定而縮?。蹐D1-(9)］,個別精子穿透透明帶［圖1-(10~11)］;可見單個精子頭部已經(jīng)穿過卵母細(xì)胞膜,并在卵母細(xì)胞表層胞質(zhì)中形成核膨脹［圖1-(10~11)］,該處卵母細(xì)胞胞質(zhì)呈錐體狀突出成為“受精錐”［圖1-(10~11)］;部分卵母細(xì)胞在精子核膨脹時即排出第二極體［圖1-(11)］。受精后卵母細(xì)胞內(nèi)雌、雄原核形成,早期兩原核相距較遠(yuǎn),第二極體與第一極體并攏［圖1-(12)］;雙原核逐漸向受精卵中央遷移［圖1-(13)］,并相互靠攏［圖1-(14)］,兩原核逐漸融合為1個［圖1-(14~15)］,核膜清晰,多個核仁清晰可見,細(xì)胞體積有所增大,表明原核遷移過程中已經(jīng)開始進(jìn)行DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成,為下一步的卵裂做準(zhǔn)備。原核融合后細(xì)胞核一分為二［圖1-(15~16)］細(xì)胞變?yōu)槎噙呅尾⒅饾u拉長［圖1-(16~17)］,細(xì)胞核向兩極遷移、細(xì)胞中央凹陷,形成“腰”

［圖1-(18~19)］;卵“腰”進(jìn)一步凹陷,細(xì)胞一分為二,形成大小相等的2細(xì)胞卵裂球［圖1-(20~21)］。隨后,2細(xì)胞卵裂球(也稱二細(xì)胞胚)內(nèi)細(xì)胞核一分為二,并出現(xiàn)極化分布［如圖1-(22~23)。長形的2細(xì)胞胚相互旋轉(zhuǎn)并再次卵裂形成4細(xì)胞胚［圖1-(23~26)］;繼而進(jìn)一步卵裂形成6細(xì)胞胚［圖1-(27)］、8細(xì)胞胚［圖1-(28)］、桑椹胚［12~16細(xì)胞,圖1-(29)］。從8細(xì)胞胚開始,細(xì)胞之間排列十分緊密,相鄰兩細(xì)胞表面緊貼［圖1-(28~29)］。隨著胚繼續(xù)培養(yǎng),多細(xì)胞的桑椹胚內(nèi)部已難以分辨細(xì)胞邊界,即所謂致密化［圖1-(30~31)］。桑椹胚后期,在胚內(nèi)部局部出現(xiàn)小的腔隙即胚泡腔,演變?yōu)槟遗?亦稱胚泡,圖1-32);胚泡腔逐漸擴(kuò)大,部分早期胚細(xì)胞形成單層扁平的胚泡壁(滋養(yǎng)層),另一部分細(xì)胞位于胚泡腔一側(cè),形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)［圖1-(33)］;繼續(xù)培養(yǎng),內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞數(shù)量增多、體積變小,胚泡腔逐步擴(kuò)大,胚胎體積增大,透明帶變?。蹐D1-(33~34)］,在充分?jǐn)U展的晚期囊胚,胚泡壁細(xì)胞間結(jié)合部特別薄［圖1-(35)］,此處是做嵌合體動物時ES細(xì)胞囊胚注射的最適合位點(diǎn)。

3討論

近年來,對小鼠早期胚進(jìn)行觀察、培養(yǎng)和操作,已經(jīng)超越了傳統(tǒng)的生殖生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)專業(yè)而成為生命科學(xué)眾多領(lǐng)域中普遍應(yīng)用的技術(shù)。因此,一個早期胚發(fā)育全過程系統(tǒng)觀察的圖譜,對推廣、普及這些技術(shù)的應(yīng)用不僅具有重要的實(shí)用價值而且具有較強(qiáng)的緊迫性。

DIC顯微術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

傳統(tǒng)對早期胚發(fā)育過程形態(tài)變化的認(rèn)識,來源于利用相差顯微鏡所進(jìn)行的觀察［1］。由于相差顯微鏡技術(shù)存在著圖像不夠細(xì)致、邊緣效應(yīng)即“光暈”顯著的固有缺點(diǎn),使其不能觀察細(xì)胞內(nèi)部和邊緣的細(xì)節(jié),從而難以適應(yīng)大多數(shù)顯微操作的需要,故當(dāng)前對細(xì)胞和胚胎進(jìn)行顯微操作時普遍使用更先進(jìn)的DIC,尤其是在進(jìn)行基因原核注射、細(xì)胞核移植和胞質(zhì)內(nèi)精子注射等實(shí)驗(yàn)中,DIC成為不可替代的工具［1］。因此,用DIC觀察小鼠早期胚發(fā)育形態(tài)成為胚胎操作實(shí)驗(yàn)中的基本功。然而,迄今尚未見利用DIC對小鼠早期胚發(fā)育全過程進(jìn)行系統(tǒng)觀察的報道及其相應(yīng)圖譜,不利于胚胎操作技術(shù)的推廣。DIC是在相差顯微鏡基礎(chǔ)上改進(jìn)的新一代活細(xì)胞觀察技術(shù)。利用DIC觀察細(xì)胞與胚胎,細(xì)胞形態(tài)呈浮雕狀的三維圖像,細(xì)胞內(nèi)外各種結(jié)構(gòu)邊界清晰、細(xì)節(jié)明顯、對比度適當(dāng),尤其是其聚焦深度較狹窄,通過調(diào)節(jié)焦距可以獲得細(xì)胞不同層面的圖像［如圖1-(1~2)］,即對細(xì)胞進(jìn)行光學(xué)切片，可以準(zhǔn)確、生動地顯示如細(xì)胞與細(xì)胞核的邊界、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器顆粒、細(xì)胞核內(nèi)的核仁、染色質(zhì)顆粒等微細(xì)結(jié)構(gòu)。目前,DIC已全面應(yīng)用于對活細(xì)胞的觀察,并可與其他光學(xué)顯微技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行細(xì)胞/胚胎的生理功能、染色體運(yùn)動和分子活動的分析［3-5］。因此,利用DIC來觀察胚胎發(fā)育過程,可以更準(zhǔn)確、精確地了解胚胎的發(fā)育狀態(tài)并便于對其進(jìn)行細(xì)致的顯微操作。本研究采用DIC顯微術(shù),全面系統(tǒng)地觀察從卵母細(xì)胞成熟至囊胚擴(kuò)展的早期胚發(fā)育全過程,觀察時間點(diǎn)密集,觀察樣本量大,各階段標(biāo)本圖像的重現(xiàn)率極高,對一些連續(xù)變化過程,如原核遷移、卵裂經(jīng)過等做了連續(xù)追蹤并對各階段的形態(tài)特征與胚胎發(fā)育時相做了較精確的對應(yīng)。對一些不易觀察的微細(xì)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu),如成熟卵母細(xì)胞紡錘體和穿入卵母細(xì)胞的精子,本研究也拍攝了明確清晰的圖像。因此本研究形成的圖譜可借鑒性強(qiáng)，為推廣胚胎培養(yǎng)和胚胎操作技術(shù)提供了有價值的實(shí)驗(yàn)資料和技術(shù)依據(jù)。

DIC操作要點(diǎn)

運(yùn)用DIC技術(shù)應(yīng)注意以下操作要點(diǎn):(1)DIC的光學(xué)特性與玻璃載體(如載玻片、玻璃培養(yǎng)皿等)相匹配,而常規(guī)使用的塑料細(xì)胞/胚胎培養(yǎng)皿,在DIC觀察時易產(chǎn)生入射光的折射而出現(xiàn)顏色變化,降低圖像的清晰度和立體感,影響攝影效果。故采用塑料培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞/胚胎時一般只適于進(jìn)行實(shí)時檢查,要進(jìn)行精確觀察和攝影時,應(yīng)將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至玻璃載體上觀察。同時,在使用恒溫載物臺時,要避免采用以塑料為材料的恒溫板。(2)DIC具有光染色效果,可調(diào)出不同彩色圖像,但以灰色調(diào)圖像的立體感和對比度最強(qiáng)。在灰色調(diào)下適宜觀察細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)及其差別。因此在做精細(xì)觀察和顯微操作時宜采用此色調(diào)。(3)DIC具有光學(xué)切片效果,對卵母細(xì)胞和早期胚這類較大的目標(biāo)可通過調(diào)節(jié)顯微鏡焦距獲得不同層面的清晰圖像。在對不同目標(biāo)進(jìn)行尺寸比較(例如卵母細(xì)胞或胚胎直徑)時要注意采用同一層面的焦距進(jìn)行觀察,例如在比較不同胚胎的大小時可采用最大直徑的層面進(jìn)行觀察。(4)在轉(zhuǎn)換標(biāo)本或者視野時應(yīng)注意觀察圖像效果的變化,必要時可通過細(xì)致調(diào)節(jié)起偏器、檢偏器、聚光器光圈達(dá)到最佳效果。

【參考文獻(xiàn)】