幽門螺桿菌cagA基因對胃癌細胞影響

幽門螺桿菌cagA基因對胃癌細胞影響

【關鍵詞】幽門螺桿菌；CagA；細胞增殖；細胞凋亡

摘要：目的觀察幽門螺桿菌野生株與cagA基因同源缺失突變株對人胃癌細胞株BGC823的細胞增殖和凋亡的影響，探討與Hp毒力基因cagA相關的細胞水平的毒性效應。方法將幽門螺桿菌野生株與cagA基因缺失突變株與BGC823細胞共培養(yǎng)，分別在6，12，24和48h觀察細胞形態(tài)學變化，采用四甲基偶氮噻唑藍比色法檢測細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果野生株和突變株Hp攻擊BGC823細胞6h，即可引起細胞的形態(tài)學變化，48h時均可觀察到細胞形態(tài)呈分散及蜂鳥樣改變。MTT法檢測顯示，野生株對BGC823細胞增殖具有抑制作用，而缺失cagA基因的突變株可刺激細胞增殖，且在24，48h的2個時間點上均高于對照組和野生株組。流式細胞分析顯示，在攻擊BGC823細胞48h后，野生株和突變株均可引起細胞凋亡，凋亡率高于對照組，2個實驗組的凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。結論Hp作用后細胞呈分散和蜂鳥樣改變并不是cagA基因特有的細胞學效應；cagA基因是Hp抑制細胞增值所必需的元素；cagA基因的有無對Hp致凋亡效應的影響不大，在Hp致細胞凋亡的效應中作用可能有限。

關鍵詞：幽門螺桿菌；CagA；細胞增殖；細胞凋亡

EffectsofcagAgeneofhelicobacterpylorionBGC823cells

Abstract:objectiveToobservetheeffectsofacagA-deletedmutantstrainofChineseonthephenotypes,proliferationandapoptosisinhumangastriccancercelllineBGC823invitro,andtodeterminethecytotoxicityofcagA,oneofthevirulencegeneofBGC823cellswereco-culturedwiththewildtypeandtheisogenousmutant,whichwerecalledthewildtuestraingroupandthemutantstaingroup,cellphenotypewasobservedat6,12,24and48handthecellularproliferationwasexaminedbymethylthiazolyltetrazolium(MTT)inductionofapoptosiswasdeterminedbyflowThechangesofcellmorphologywereobservedwhenBGC823cellswereco-culturedwithfor6hours,andcellscatterringandhummingbirdmorphology(cellelongation)werepresentedafterco-culturedfor48hoursinbothMTTassayshowedthattheviabilityofBGC823cellswasinhibitedinthewildtypestraingroup,whilewassignificanthigherinthemutantstraingroupthanthatofthecontrolgroupandthewildtypestraingroupwhenco-culturedwithfor24and48hours,demonstratedbyflowcytometry,theapoptoticrateinboththewildtypeandthemutantgroupwashigherthanthatofcontrolgroup(),buttherewasnodifferencebetweenthetwogroupstreatedwithConclusionsCellscatterringandhummingbirdphenotype(cellelongation)werenotthecellmorphologycharacteristicsspecificrelatedtothecagAgeneaftertreatedwith;ThecagAgenemayplaythecrucialrolein‘sactionsofinhibitingcellularproliferation;ThecagAgenemayhavetheonlylimitedeffectsonthecellularapoptosisinducedby

Keywords:helicobacterpylori;cagA;cellproliferation;apoptosis

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是一種可長期定植于人類胃粘膜的革蘭陰性微需氧菌，在全世界范圍內感染率超過50%。Hp是引起萎縮性胃炎和胃潰瘍等慢性炎癥的致病因子，流行病學和動物實驗證實，Hp慢性感染是導致胃癌的重要危險因素，世界衛(wèi)生組織已將其列為一類致癌原〔1〕。然而Hp確切的致癌機制至今仍不清楚。細胞毒素相關基因A蛋白(cytotoxinassociatedgeneA，CagA)是Hp重要的毒力因子之一。流行病學研究認為，CagA陽性Hp感染與消化性潰瘍和胃癌發(fā)生的關系比CagA陰性菌株更為密切，提示cagA在Hp致病過程中可能具有重要作用〔2,3〕。世界范圍內不同Hp菌株CagA分子變異較大，該變異可能導致不同菌株的CagA生物學作用乃至致病性不同〔4〕。我國作為Hp感染較嚴重的國家之一，臨床分離株中超過90%含有cagA基因，但對于毒力因子CagA的生物學功能不甚明了。另外，由于cagA陽性野生株與cagA陰性自然突變株之間缺乏除cagA基因以外的相同遺傳背景，所以無法對cagA基因功能做出真實判斷。為此，本室在自行構建的幽門螺桿菌中國株cagA基因缺失突變株的基礎上，探討野生株與突變株對人胃癌細胞株BGC823細胞增殖和凋亡的影響，旨在揭示與Hp毒力基因cagA相關的細胞水平的毒性效應。結果報告如下。

1材料與方法

11材料菌株與細胞株：幽門螺桿菌野生株MEL-Hp27(Hp27)為本教研室從鄭州市慢性萎縮性胃炎患者體內分離并保種；cagA基因缺失突變株MEL-Hp27△cagA為本室自行構建，cagA基因被完全敲除掉，代之以卡那抗性基因；低分化胃癌細胞株BGC823細胞由鄭州大學第一附屬醫(yī)院周慧聰博士惠贈。試劑與儀器：四甲基偶氮噻唑藍(MTT)；FTTC-AnnexinV/PI標記液；紫外分光光度計。酶標儀；流式細胞儀。

12方法

121Hp的培養(yǎng)將野生株MEL-Hp27和突變株MEL-Hp27△cagA分別接種于含10％羊血的布氏平板培養(yǎng)基，37℃、微需氧條件下培養(yǎng)，3d后收集細菌，用PBS制成細菌懸液，在分光光度計上測定細菌濃度，然后用含10％胎牛血清的無抗生素RPMI-1640培養(yǎng)液調整適當濃度用于攻擊細胞。

122BGC823細胞培養(yǎng)BGC823細胞的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的無抗生素RPMI-1640培養(yǎng)液，細胞置于37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

123BGC823細胞與Hp共培養(yǎng)BGC823細胞于37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換用含Hp的細菌懸液，置于37℃微需氧環(huán)境中共培養(yǎng)；對照組只含10％胎牛血清的無抗生素RPMI-1640培養(yǎng)液；野生株組和突變株組細菌與細胞的比例均為100∶1。

124細胞形態(tài)學觀察BGC823細胞以1×104個/孔接種于24孔板中，分別于細菌與細胞共同培養(yǎng)的6，12，24，48h對細胞形態(tài)進行觀察。

125細胞增殖測定采用MTT法，細胞以5×103/孔密度接種于96孔板上，每組設6個復孔，分別在細菌與細胞共培養(yǎng)的12，24，48h于每孔加入MTT20μl，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO150μl，室溫避光搖床上充分振蕩10min，在酶標儀上測定各孔A492nm吸光度(A)值并記錄結果。

126細胞凋亡測定細胞以5×105/孔的密度接種于6孔板上，置于37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換用含Hp的細菌懸液，置于CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)。在細胞與細菌共培養(yǎng)48h后，胰酶消化細胞，1000r/min離心10min,收集細胞,冷PBS洗3遍，以FTTC-AnnexinV/PI雙標記后,流式細胞儀檢測，該方法能區(qū)別凋亡細胞和壞死(PI標記)細胞。

2結果

21細胞形態(tài)學圖1可見，人胃癌細胞BGC823株經(jīng)野生株和突變株Hp攻擊

后，均出現(xiàn)明顯的形態(tài)學變化，并隨Hp與細胞共培養(yǎng)時間的延長，細胞形態(tài)學變化越明顯。對照組細胞貼壁生長良好，輪廓清晰，呈多邊形，胞質內顆粒較少。而野生株和突變株Hp攻擊細胞6h，即可見細胞周邊有較多細菌附著,細胞有脫壁現(xiàn)象，培養(yǎng)液中可見細胞崩解后的殘留顆?；蚓w；培養(yǎng)48h后，可見細胞形態(tài)呈分散及蜂鳥樣改變。

圖1Hp與細胞共培養(yǎng)各時間點細胞形態(tài)學變化

22細胞增殖活性(表1)表1可見，在Hp與細胞共培養(yǎng)的12h，野生株和突變株組細胞的增殖活性與對照組相比差別不大；培養(yǎng)24h時各組細胞增值活性差異有統(tǒng)計學意義，其中突變株組細胞增值活性明顯高于野生株組和對照組，野生株組細胞增值受抑制，明顯低于對照組；培養(yǎng)48h時各組細胞增值活性差異仍有統(tǒng)計學意義，兩兩比較顯示，突變株組細胞增值活性高于野生株組和對照組。

表1Hp與BGC823細胞共培養(yǎng)不同時間點的MTT值

注:與對照組比較,*P0005；與對照組及野生組比較,**P005

23細胞凋亡率以100:1的細菌與細胞比例共培養(yǎng)48h后,流式細胞儀分析顯示，野生株組和突變株組細胞凋亡率分別為843%和913%，均高于對照組凋亡率273%,但2組差異無統(tǒng)計學意義。

圖2各組凋亡率比較

3討論

由于Hp菌株自身的變異，cagA陽性株與cagA陰性株間除cagA基因外存在許多差異，在自然狀態(tài)下很難對cagA基因功能做出真實判斷。為此，本室自行構建了幽門螺桿菌中國株cagA基因缺失突變株，并在此基礎上觀察了遺傳背景相同的野生株與突變株對人胃癌細胞株BGC823細胞增殖和凋亡的影響，以期揭示cagA基因細胞水平的毒性效應。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在Hp與細胞共培養(yǎng)6h即可觀察到細胞形態(tài)學的改變，在培養(yǎng)48h后，均可導致細胞的分散或蜂鳥樣改變，與Stefan等〔5〕的報道相似。但是未發(fā)現(xiàn)野生株與cagA基因缺失突變株對細胞形態(tài)學的影響存在差異，可見，cagA基因缺失仍然可以造成與野生株作用相似的細胞形態(tài)學變化，提示Stein等〔6〕報道的cagA基因引起的細胞分散和蜂鳥樣改變的效應可能并不是cagA基因所特有的作用。野生株與突變株雖然可以引起相似的細胞形態(tài)學變化，二者的作用機制也可能不同。本研究結果顯示，野生株對BGC823細胞具有抑制作用，而缺失cagA基因的突變株卻可刺激細胞增殖，且在24，48h2個時間點上都高于對照組和野生株組。由此可見，cagA基因在Hp抑制細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用，甚至是必需的元素。至于cagA基因缺失后Hp為何促進細胞增殖，還有待于進一步研究。細胞凋亡在維持胃腸道粘膜組織的完整性中起著非常重要的作用，細胞凋亡與增殖之間的動態(tài)平衡是上皮細胞更新循環(huán)、維持穩(wěn)態(tài)的重要途徑〔7〕。佘菲菲等〔8〕在細胞內表達CagA蛋白，并研究了cagA和凋亡的關系，認為CagA可以誘導胃上皮細胞凋亡。但由于是通過載體在細胞內表達CagA蛋白，與Hp在自然情況下攻擊細胞的情形不同，且只能分析cagA本身在細胞內的作用，不能全面揭示與cagA相關的生物學功能，因此，對cagA基因功能的評價并不完全。本研究結果顯示，野生株和cagA基因缺失突變株在與細胞共培養(yǎng)48h后均可引起細胞凋亡，但2組凋亡率之間差異無統(tǒng)計學意義，提示cagA基因在Hp誘導細胞凋亡的過程中作用有限，cagA基因有無對Hp致凋亡效應的影響并不大，即CagA可能不是Hp誘導細胞凋亡的關鍵因子。本實驗利用細胞與細菌共同培養(yǎng)技術建立了體外Hp急性感染的細胞模型，并且比較了中國幽門螺桿菌野生株與cagA基因同源缺失突變株對胃癌細胞株BGC823細胞的影響，進一步豐富了有關中國幽門螺桿菌cagA基因功能的研究內容。本研究發(fā)現(xiàn)，Hp作用后細胞呈分散和蜂鳥樣改變并不是cagA基因特有的細胞學效應；cagA基因是Hp抑制細胞增值所必需的元素；cagA基因在Hp致細胞凋亡的效應中作用可能有限。

參考文獻

〔1〕Radosz-KomoniewskaH,BekT,JozwiakofHelicobacterpyloriinfection［J］.ClinMicrobiolInfect,2005,11(8):602-610.

〔2〕RuggeM,BusattoG,CassaroM,etyoungerthan40yearswithgastriccarcinomaHelicobacterpylorigenotypeandassociatedgastritisphenotype［J］.Cancer,1999,85(12):2506-2511.

〔3〕NomuraM,LeeJ,StemmermannGN,etpyloriCagAseropositivityandgastriccarcinomariskinaJapaneseAmericanpopulation［J］.JInfectDis,2002,186