bcl2基因轉(zhuǎn)染對人胃上皮細(xì)胞GES

bcl2基因轉(zhuǎn)染對人胃上皮細(xì)胞GES

作者：朱麗華，李淑英，周洪霞，習(xí)瑾昆，章廣玲，周天戟

【關(guān)鍵詞】bcl2基因

【Abstract】AIM：Toobservetheeffectofbcl2genetransfectionontheproliferationofhumangastricepithelialcellGES1.METHODS：Theeukaryoticvectorcarryingthefulllengthofbcl2geneandtheneomycinresistancegene(pcDNA3/bcl2)andtheoneonlycarryingtheneomycinresistancegene(pcDNA3)wereamplifiedandpurified.TheplasmidofpcDNA3/bcl2wasusedtotransfectGES1cellsbyusingthelipofectamine,andtheemptyvectorpcDNA3totransfectGES1cellsascontrols.Andthen,thecellswereculturedin1640culturemediumcontaininganappropriateconcentrationofG418forselection.ThemethodofHRPlabelimmunohistochemicalstainingwasusedtoidentifythecellsexpressingbcl2genepositively.ThemorphologicchangesofGES1cellswereobservedunderanopticalmicroscopebyHEstaining.Thecellproliferationaffectedbythetransfectionofbcl2wasmeasuredbycellcountingandMTTassay.RESULTS:bcl2geneandthevectorpcDNA3weretransfectedseparatelyintoGES1cellsbylipofectamine.AfterG418selection,thecellsweretransfectedsteadily.Comparedwithcontrols,HRPlabelimmunohistochemicalstainingshowedthatbcl2genetransfectedcellsexpressedBcl2proteinmuchmoreobviously.NomorphologicchangeswereobservedbyHEstaining.Thegrowthcurvewasdrawnbythemethodofcellcounting，whichshowedthatthegrowthofbcl2genetransfectedcellswasfasterthanthatofemptyvectortransfectedcellsanduntransfectedcellsafter6dculture.AndMTTassayshowedthatthegrowthofbcl2genetransfectedcellswere±，±and±,respectively.WhileMTTassayshowedthatthegrowthofcontrolcellswere±，±and±,respectively.Significantdifferenceswerefoundbetweenthe2groups().CONCLUSION:Thetransfectedofbcl2genemakesthecellsexpressBcl2proteinsteadilyandhighly,andenhancesthecellsproliferationandmalignancy.

【Keywords】bcl2gene;transfection;gastricmucosa;epithelialcell;GES1;proliferation

【摘要】目的：觀察bcl2基因脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人胃上皮細(xì)胞系GES1及其轉(zhuǎn)染后對GES1細(xì)胞增殖的影響.方法：以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染構(gòu)成bcl2基因表達(dá)的人胃上皮細(xì)胞系GES1細(xì)胞模型，空載體質(zhì)粒pcDNA3轉(zhuǎn)染GES1細(xì)胞及正常GES1細(xì)胞為對照；經(jīng)酶標(biāo)免疫組織化學(xué)法鑒定bcl2基因表達(dá)陽性細(xì)胞；用HE染色法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；并采用細(xì)胞計(jì)數(shù)及MTT法分析bcl2轉(zhuǎn)染后對GES1細(xì)胞增殖的影響.結(jié)果：脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染bcl2基因后，細(xì)胞高表達(dá)Bcl2蛋白；HE染色后形態(tài)學(xué)觀察無明顯改變；細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示bcl2基因轉(zhuǎn)染6d后細(xì)胞生長速度明顯超過對照組，MTT法結(jié)果顯示bcl2基因轉(zhuǎn)染第24,48,72h，A490nm值分別為±，±，±，對照組分別為±，±，±，兩組相比較具有顯著性差異().結(jié)論：bcl2基因轉(zhuǎn)染使GES1細(xì)胞穩(wěn)定且高表達(dá)Bcl2蛋白，并促進(jìn)了細(xì)胞增殖.

【關(guān)鍵詞】bcl2基因；轉(zhuǎn)染；胃黏膜；上皮細(xì)胞；GES1；增殖

0引言

胃癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段的發(fā)展過程.bcl2是近年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，其異常表達(dá)與胃癌、宮頸癌、胃腸道等腫瘤發(fā)生發(fā)展尤為密切［1-3］.我們探討bcl2基因在人胃上皮細(xì)胞系GES1中的表達(dá)情況，探討該基因表達(dá)量與人胃上皮細(xì)胞生長特性之間的關(guān)系如下.

1材料和方法

材料正常人胃上皮細(xì)胞系GES1，本室保存；質(zhì)粒pcDNA3由日本北海道大學(xué)醫(yī)學(xué)部遺傳醫(yī)學(xué)研究所腫瘤病毒學(xué)部門高田賢藏教授惠贈(zèng)；Lipofectamine、DMEM培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、MTT、胎牛血清購于Gibco公司；小鼠抗Bcl2、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購于北京華美生物制品公司；Olympus光學(xué)顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品.

方法細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine［4］轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行，基因轉(zhuǎn)染48h后，換用含300mg／LG418的完全培養(yǎng)基篩選.取待染細(xì)胞爬片，固定，滴加30mL/LH2O2，室溫孵育15min，滴加1∶100稀釋的小鼠抗Bcl2mAb，4℃濕盒中過夜，PBS洗，滴加山羊抗小鼠IgGHRP結(jié)合物，37℃，孵育30min，PBS洗滌，DAB溶液顯色5min，PBS終止反應(yīng)；自來水充分沖洗，系列乙醇脫水，二甲苯使其透明，中性樹膠封片，檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Bcl2蛋白的表達(dá).轉(zhuǎn)染bcl2的GES1細(xì)胞經(jīng)HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并照相.另接種細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中，每孔接種3×106/L.每天取3個(gè)孔計(jì)數(shù)，測出每孔中的細(xì)胞總數(shù)，求出每組平均值，持續(xù)計(jì)數(shù)10d,繪制生長曲線.細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24,48,72h后每孔加入MTT溶液20μL，37℃，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液.每孔加入DMSO150μL，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解.選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各A值，記錄結(jié)果.空載體質(zhì)粒pcDNA3轉(zhuǎn)染GES1細(xì)胞及正常GES1細(xì)胞為對照.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較使用Dunnettt檢驗(yàn).

2結(jié)果

轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Bcl2蛋白表達(dá)與對照組(GES1和GES1/PcDNA3組)比較，免疫組織化學(xué)染色法顯示bcl2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞均有Bcl2蛋白表達(dá)，且明顯高于對照組.另經(jīng)HE染色，光鏡觀察，bcl2基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)未見改變.

細(xì)胞生長速度繪制生長曲線結(jié)果表明bcl2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞于第4日后生長速度明顯高于對照組.培養(yǎng)24,48和72h轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖明顯增高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，轉(zhuǎn)染組和對照組相比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.表1bcl2基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖

3討論

Bcl2高表達(dá)是對各種凋亡刺激的保護(hù)，因此Bcl2低表達(dá)或缺失的細(xì)胞死亡率明顯增加.bcl2基因被證明在抑制細(xì)胞向凋亡的轉(zhuǎn)變中起重要作用,可以抵抗和抑制多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的存活力，參與細(xì)胞增殖與凋亡動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控［5-6］.轉(zhuǎn)染bcl2基因可抑制化療藥物、加熱、放射線、細(xì)胞生長因子撤銷、cmyc或p53基因等多種因素誘導(dǎo)的多種細(xì)胞的凋亡，延長細(xì)胞生存時(shí)間［7-8］.我們用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法，將含有人bcl2cDNA的真核表達(dá)載體pcDNA3導(dǎo)入人胃上皮細(xì)胞系GES1，成功地建立了100％穩(wěn)定表達(dá)Bcl2蛋白的GES1bcl2.

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