限制性內(nèi)切酶原理

限制性核酸內(nèi)切酶演講者：王凱本文檔共40頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期一\22點2分限制酶II型限制酶本文檔共40頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期一\22點2分限制酶的定義1

限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，簡稱限制酶。限制酶在基因工程中廣為使用。本文檔共40頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期一\22點2分限制性核酸內(nèi)切酶分布極廣，幾乎在所有細菌的屬、種中都發(fā)現(xiàn)至少一種限制性內(nèi)切酶。細菌通過自身的限制酶，破壞入侵的外源DNA，從而保護自身。本文檔共40頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期一\22點2分30多年前，當(dāng)人們在對噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象進行研究時，首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。細菌可以抵御新病毒的入侵，而這種“限制”病毒生存的辦法則可歸功于細胞內(nèi)部可摧毀外源DNA的限制性內(nèi)切酶。首批被發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶包括來源于大腸桿菌的EcoRI和EcoRII，以及來源于流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）的HindII和HindIII。這些酶可在特定位點切開DNA，產(chǎn)生可體外連接的基因片段。限制酶的發(fā)現(xiàn)本文檔共40頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期一\22點2分命名EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號本文檔共40頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期一\22點2分切割頻率

切割頻率是指某限制性核酸內(nèi)切酶在DNA分子中預(yù)期的切割概率?？梢怨浪阍撓拗菩院怂醿?nèi)切酶在某種DNA分子中的切點數(shù)。前提是：假定DNA的堿基組成是均一的、堿基排列在DNA分子上是隨機分布的。這樣每個位點上，每一種堿基出現(xiàn)的概率即為1/4

。如果某限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列是6bp，則其切割頻率為(1/4)6=1/4096，即每隔4.1kb就可能有一個切割點。當(dāng)識別序列為n個bp，則其切割頻率為（1/4）n

。本文檔共40頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期一\22點2分限制酶的種類2I型限制酶通常其切割位點與識別位點相距千個堿基,不能準確定位切割位點。例如：EcoB、EcoK。II型限制酶所識別的序列多為短的回文序列，切割位點與識別位點一致。是基因工程上，實用性較高的限制酶種類。例如：EcoRI、HindIII。III型限制酶切割位點與識別位點相距24-26個堿基，不能準確定位切割位點。例如：EcoPI、HinfIII。本文檔共40頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期一\22點2分什么是回文序列？GAATTAAGCTTAATTCGAATATTCCTTATAAG本文檔共40頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期一\22點2分II型限制酶ApaI

識別序列：5'GGGCC^C3'BamHI識別序列：

5'G^GATCC3'BglII

識別序列：5'A^GATCT3'EcoRI

識別序列：5'G^AATTC3'HindIII

識別序列：5'A^AGCTT3'KpnI

識別序列：5'GGTAC^C3'NcoI

識別序列：5'C^CATGG3'NdeI

識別序列：5'CA^TATG3'NheI

識別序列：5'G^CTAGC3'NotI

識別序列：5'GC^GGCCGC3'SacI

識別序列：5'GAGCT^C3'SalI

識別序列：5'G^TCGAC3'

SphI

識別序列：5'GCATG^C3'XbaI

識別序列：5'T^CTAGA3'XhoI

識別序列：5'C^TCGAG3'

本文檔共40頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期一\22點2分II型限制酶切割DNA后形成粘性末端或平末端分別由錯位切和平切形成。能形成粘性末端的酶在基因工程中應(yīng)用最多。粘性末端和平末端

5’NNNGTTAACNNN3‘

3’NNNCAATTGNNN5‘5’NNNGTTAACNNN3’3‘NNNCAA

TTGNNN5’5’NNNGCGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGCGNNN5‘5’NNNGCGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGCGNNN5‘HaeⅠ的識別序列NotⅠ的識別序列本文檔共40頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期一\22點2分5’粘性末端和3’粘性末端5’NNGCGGCCGCNN3‘3’NNCGCCGGCGNN5‘5’NNNGC-OH

P-GGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGG-P

HO-CGNNN5‘5’粘性末端3’粘性末端5’NNGGTACCNN3‘3’NNCCATGGNN5‘5’NNGGTAC-OHP-CNN3‘3’NNC-PHO-CATGGNN5‘本文檔共40頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期一\22點2分同尾酶切割不同的DNA片段但產(chǎn)生相同的粘性末端的一類限制性內(nèi)切酶。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’

Xho

Ⅱ本文檔共40頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期一\22點2分同裂酶

有一些來源不同的限制酶識別的是同樣的核苷酸靶子序列，這類酶稱為同裂酶。識別序列和切割位點都相同的叫同序同切酶，識別序列相同但切割位點不同的叫同序異切酶。例如：HpaⅡ和MspI為同序同裂酶（C^CGG）。XmaI和SmaI為同序異裂酶，都識別CCCGGG，但XmaI的切點在C^CCGGG，形成帶有CCGG的粘性末端；而SmaI的切點則在CCC^GGG，形成平末端。本文檔共40頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期一\22點2分有些限制酶識別的序列不是回文序列。

AccⅠ的識別切割位點分別是GTAGAC

和

GTCTACBbvCⅠ的識別切割位點分別為CCTCAGC和GGAGTCG特殊的II型限制酶GT↓ATCGACCATAGC↑TGCC↓TCAGCGGAGT↑CG本文檔共40頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期一\22點2分1)

DNA的純度2)

DNA的甲基化程度3)

酶切消化反應(yīng)的溫度4)

DNA的分子結(jié)構(gòu)5)

限制性核酸內(nèi)切酶的緩沖液6)

Star活性（星活性）影響限制性酶活性的因素本文檔共40頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期一\22點2分

限制酶消化DNA底物的反應(yīng)效率，很大程度上取決于所使用的DNA的純度。DNA制劑中的含有蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高濃度的鹽離子等都有可能抑制限制酶的活性。提高限制酶對低純度DNA的反應(yīng)效率，一般采用三種方法：①增加限制酶的用量。②擴大酶催化反應(yīng)的體積。（以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)地稀釋）③延長酶催化反應(yīng)的保溫時間。DNA的純度本文檔共40頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期一\22點2分DNA的甲基化程度識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，會嚴重影響酶的催化效率。為避免這樣的問題，在基因克隆中使用的質(zhì)粒DNA是從失去甲基化酶的大腸桿菌菌株中提取的。本文檔共40頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期一\22點2分酶切消化反應(yīng)的溫度

不同的限制酶具有不同的最適反應(yīng)溫度。大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標準反應(yīng)溫度是37℃，有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度低于標準的37℃，SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些高于標準的37℃，例如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃。本文檔共40頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期一\22點2分DNA的分子結(jié)構(gòu)

DNA分子的不同構(gòu)型對限制酶的催化效率也有很大的影響。某些限制酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍，最高的可達20倍。本文檔共40頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期一\22點2分核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液II型限制酶的最適pH一般是6-8,緩沖液中通常含有Mg2+。本文檔共40頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期一\22點2分Star活性（星活性）限制酶在一些特定條件下使用時，識別位點的特異性降低，可以把不同于正常識別的序列切斷，這個現(xiàn)象叫Star活性。Star活性出現(xiàn)的頻率，根據(jù)酶、底物DNA、反應(yīng)條件的不同而不同。Star活性主要受低粒子強度、高pH值以及過高的甘油濃度的影響。本文檔共40頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期一\22點2分本文檔共40頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期一\22點2分本文檔共40頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期一\22點2分本文檔共40頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期一\22點2分

消化DNA樣品后，需要鈍化內(nèi)切酶的活性，終止反應(yīng)。方法：1）65℃溫浴5-10分鐘，使酶失活。2）加入EDTA除去酶分子的鎂離子，是使酶失活。3）加SDS或者尿素使酶解聚沉淀。4）用等體積的酚抽提酶解產(chǎn)物，提取DNA。限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止本文檔共40頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期一\22點2分限制性內(nèi)切酶的保存限制酶于-20℃用50％的甘油保存。本文檔共40頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期一\22點2分基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、堿性磷酸酶、末端轉(zhuǎn)移酶、甲基化酶。Ⅱ型限制酶在基因工程中的的應(yīng)用3本文檔共40頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期一\22點2分

將目的基因?qū)胧荏w細胞前，需要用相同的限制酶將目的基因和載體切成相同的粘性末端，再通過堿基互補配對的方式，在連接酶的作用下，目的基因和載體完成連接。最后將連接好的重組載體導(dǎo)入細胞。???NNAAGCTTNN???NNGGATCCNNN??????NNTTCG

AANN???NNCCTAGGNNN???HindIIIBamHINNNNNNNNNNNAAGCTTNN???NNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNN

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AANN??NNCCTAGGNNNNNNNNNNNNHindIIIBamHI雙酶切法本文檔共40頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期一\22點2分NNNNNNNNNNNAAGCTTNN???NNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNN

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??NNCCTAGGNNNNNNNNNNNN本文檔共40頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期一\22點2分為什么通常要用兩種限制酶？可以有效防止載體自連造成空載體。本文檔共40頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期一\22點2分連接酶本文檔共40頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期一\22點2分可不可以用一種酶切割目的基因和載體？

可以，此時切割后的載體需要加入堿性磷酸酶處理。堿性磷酸酶可以去除酶切后切口的磷酸，從而使粘性末端在加入連接酶后不能重新結(jié)合。5’NNNGCGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGCGNNN5‘5’NNNGC-OH

p-GGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGG-p

HO-CGNNN5‘5’NNNGC-OHGGCCGCNNN3‘3’NNNCGCCGGHO-CGNNN5‘堿性磷酸酯酶單酶切法本文檔共40頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期一\22點2分NNNNNNNNNNNAAGCTTNN???NNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNN

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AANN??NNCCTAGGNNNNNNpAGCTTNN???NNA-OH

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NNNNNNNNNNNAAGCTTNN???NNNAAGCTTNNNNNNNNNNNNNNNNNN

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??NNTTCGAANNNNNNNNNNNNDNA連接酶本文檔共40頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期一\22點2分基因工程中，很多情況下，基因組中靠近目的基因兩側(cè)的堿基并沒有合適的酶切位點。怎么辦？Hsp70A：Ex-F5'CGCCA^TATGCCAGCTATCGGAATCGATTTGG3'

NdeIHsp70A：Ex-R5'GC^GGCCGCATAAAGGTGGGGAGAGCTTACAAC3'

NotI通常是設(shè)計合適的PCR引物，讓目的基因在PCR擴增后，兩側(cè)含有酶切位點。本文檔共40頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期一\22點2分DNA甲基化酶4甲基化酶：可以從活性甲基化合物(如S-腺苷甲硫氨酸)上將其甲基轉(zhuǎn)移