分光光度分析

關(guān)于分光光度分析第1頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三學習要求1、掌握紫外-可見分光光度分析的特點、基本原理、測定條件的選擇、測定實驗技術(shù)、定性和定量分析方法及有關(guān)術(shù)語。2、掌握紫外-可見分光光度計的結(jié)構(gòu)，使用、維護和保養(yǎng)方法。第2頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三基于物質(zhì)光學性質(zhì)而建立起來的分析方法稱之為光學分析法，分為:光譜分析法和非光譜分析法（如比色法、旋光測定法）。

光譜分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通過測量物質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)射光、吸收光或散射光的波長和強度來進行分析的方法。

光學分析法概述第3頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三在光譜分析中，依據(jù)物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法，按所用光的波長不同分為:

原子吸收光譜：利用物質(zhì)的氣態(tài)原子對特定波長的光的吸收來進行分析的方法。

紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長范圍2.51000m（紅外光區(qū)），主要用于有機化合物結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。

紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200400nm（近紫外區(qū)），可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。

可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400760nm（可見光區(qū)），主要用于有色物質(zhì)的定量分析。本章主要講授紫外-可見吸光光度法。主要光譜分析法第4頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三第一節(jié)分光光度分析的基本原理1、物質(zhì)對光的選擇性吸收

光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波動性可用波長、頻率、光速c、波數(shù)（cm-1）等參數(shù)來描述：

=c

；波數(shù)=1/=/c

光是由光子流組成，光子的能量：

E=h=hc/

（h=6.626×10-34J·Sh---Planck常數(shù)

)光的波長越短（頻率越高），其能量越大。一、朗伯-比耳定律1.1光的特性第5頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三白光（400-760nm，日光、白熾燈光等）是一種復合光，它是由各種顏色的光按一定比例混合而得的。利用棱鏡等分光器可將它分解成紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等不同顏色的單色光。波長/nm400~430430~480480~500500~560560~590590~620620~760顏色紫色藍色青色綠色黃色橙色紅色可見光波譜單色光：單波長的光(由具有相同能量的光子組成)。第6頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三白光除了可由所有波長的可見光復合得到外，還可由適當?shù)膬煞N顏色的光按一定比例復合得到。能復合成白光的兩種顏色的光叫互補色光。/nm顏色互補光400-450紫黃綠450-480藍黃480-490綠藍橙490-500藍綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍610-650橙綠藍650-760紅藍綠黃綠青橙白光青藍紅紫紅藍互補色光示意圖第7頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三當白光照射到物質(zhì)上時，如果物質(zhì)對白光中某種顏色的光產(chǎn)生了選擇性的吸收，則物質(zhì)就會顯示出一定的顏色。物質(zhì)所顯示的顏色是吸收光的互補色。物質(zhì)吸收黃光，透過藍光：CuSO4吸收黃光，顯藍色。物質(zhì)吸收藍光，透過黃光互補光:藍光和黃光1.2物質(zhì)的顏色第8頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三2、透射比(透過度、透光率)T和吸光度（T：0~1）透射比T:描述入射光透過溶液的程度。吸光度A與透光率T的關(guān)系:A

＝－lgT第9頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三布格爾(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系：A∝l

1852年，比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系：A∝c

綜合考慮，即一束平行單色光通過有色溶液，溶液的吸光度與溶液的濃度和厚度成正比。

3、朗伯—比耳定律第10頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三

A＝lg（I0/It)=klc

A：吸光度，描述溶液對光的吸收程度；

l：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的濃度，單位g·L-1

k：吸光系數(shù)，單位L·g-1·cm-1

朗伯—比耳定律數(shù)學表達式吸光系數(shù)k(L·g-1·cm-1）相當于濃度為1g/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。第11頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三A＝lg（I0/It)=εlc

式中

c：溶液的物質(zhì)的量濃度，單位mol·L-1；

ε：摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol-1·cm-1；ε與k的關(guān)系為：

k=ε/M（M為摩爾質(zhì)量）

4、摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)ε在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。摩爾吸光系數(shù)是物質(zhì)吸光能力的量度，可作為定性分析的參考。其值越大，方法的靈敏度越高。第12頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的依據(jù)。應用于各種光度法的吸收測量；吸收定律的適用條件1．必須是使用單色光為入射光；2．溶液為稀溶液；3．吸收定律能夠用于彼此不相互作用的多組分溶液。它們的吸光度具有加合性，且對每一組分分別適用，即：

A總=A1+A2+A3…+An=k1lc1+k2lc2+k3lc3…+knlcn4．吸收定律對紫外光、可見光、紅外光都適用。第13頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三標準曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標準曲線常發(fā)生彎曲（尤其當溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。5、偏離朗伯—比耳定律的因素第14頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三（1）單色光不純引起的偏離實際上，分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復合光可導致對朗伯—比耳定律的正或負偏離。（2）介質(zhì)不均勻引起的偏離當溶液中含有懸浮物或膠粒等散射質(zhì)點時，入射光通過溶液時就會有一部分光因散射而損失掉，使透過光強度減小，測得的吸光度增大，從而引起偏離吸收定律。第15頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三（3）與測定溶液有關(guān)的因素朗伯—比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用。這只有在稀溶液(c<0.01mol/L)時才基本符合，當溶液濃度較高時，吸光質(zhì)點間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對光的吸收。故朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學平衡時，使吸光質(zhì)點的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。第16頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三分光光度法主要應用于測試樣中微量組分，與滴定分析、重量分析法相比，有如下特點：

1、靈敏度高下限一般可達10-4-10-7g/mL2、準確度高相對誤差1-3%3、操作簡便

4、測定快速

5、有一定的選擇性

6、儀器簡單二、分光光度法的特點及應用第17頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三例題：已知某化合物的相對分子量為251，將此化合物用已醇作溶劑配成濃度為0.150mmol/L溶液，在480nm處用2.00cm吸收池測得透光率為39.8%，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)和吸光系數(shù)。解：已知溶劑濃度c=0.150mmol/L，l=2.00cm,T=0.398,由Lambert-Beer定律得：

ε（480nm）=A/cl=-lg0.398/0.150×10-3×2.00=1.33×103(L·mol-1·cm-1)由ε=kM,得K=ε/M=ε/251=5.30(L·g-1·cm-1)第18頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三第二節(jié)分光光度分析的樣品前處理固體樣品：干法消化、濕法消化、溶劑萃取液體樣品：消除干擾物質(zhì)（離子）第19頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三第三節(jié)分光光度分析的條件選擇控制溶液吸光度在0.2-0.7之間。一、試樣濃度控制方法：1）控制溶液濃度A>0.7時，稀釋后測量；A<0.2時，擴大取樣量或濃縮后測量。2）控制液層厚度A>0.7時，選擇光程小的吸收池；A<0.2時，選擇光程大的吸收池。

第20頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三吸收曲線的討論（2）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似，λmax不變。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。（1）同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應的波長稱為最大吸收波長λmax。二、測定波長的選擇第21頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三(5)在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。(3)吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。(4)不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。第22頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三第23頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三顯色反應----被測組分和某種試劑反應后生成有色物質(zhì)的反應。通過顯色反應，可以加深被測組分的顏色。顯色反應的靈敏度用摩爾吸收系數(shù)ε表示。ε

>105：超高靈敏；

(6～10）×104：高靈敏；<2×104：不靈敏。三、顯色條件的選擇第24頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三靈敏度高---εmax最大；選擇性好---顯色劑只與被測物質(zhì)反應。有色化合物組成固定---有定量關(guān)系。顯色產(chǎn)物穩(wěn)定---便于測定。1、顯色劑的選擇無機顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨、過氧化氫等幾種。有機顯色劑：種類繁多。偶氮類顯色劑：本身是有色物質(zhì)，生成配合物后，顏色發(fā)生明顯變化；具有性質(zhì)穩(wěn)定、顯色反應靈敏度高、選擇性好、對比度大等優(yōu)點，應用最廣泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。三苯甲烷類：鉻天青S、二甲酚橙等第25頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三

吸光度A與顯色劑用量CR的關(guān)系會出現(xiàn)如圖所示的情況。2、顯色劑用量對一系列濃度相同的試液，加入不同量的顯色劑，分別測定其吸光度，如果在某一濃度范圍內(nèi)所測得的吸光度不變，就可以在此范圍內(nèi)確定顯色劑的用量。顯色反應的速度有快有慢，快的幾乎是瞬間完成，顏色很快達到穩(wěn)定狀態(tài)，并且能保持較長時間。大多數(shù)顯色反應的速度是比較慢的，需要一定時間才能達到穩(wěn)定。而且有些有色化合物放置過久也會褪色。適宜的顯色時間要由實驗來確定。3、顯色時間第26頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三1、對溶液中待測組分狀態(tài)的影響很多高價金屬離子都會水解，酸度較低時，不利于顯色反應的進行。2、對顯色劑本身顏色的影響很多顯色劑都是有機弱酸，如果控制不好酸度，就會使指示劑顏色與有色化合物的顏色相近而影響測定。四、pH的選擇酸度對顯色反應的影響很大，因為溶液酸度直接影響著金屬離子、顯色劑的存在形式和有色化合物的組成、穩(wěn)定性等。比如：用二甲酚橙為顯色劑，它與金屬離子形成的配合物為紅色，它本身在pH<6.3時為檸檬黃色，而在PH＞6.3時為紅紫色。所以在pH＞6.3時，就無法進行測定。第27頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三3、對顯色劑反應的影響許多顯色反應是配位反應，伴隨酸效應，故酸度對顯色反應影響較大。在相同實驗條件下，分別測定不同pH值條件下顯色溶液的吸光度。選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對應的pH范圍。一般顯色反應在室溫下進行，但是也有一些反應要加熱到一定溫度下才能進行。而且還有一些有色配合物在室溫下會分解。五、溫度的選擇第28頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三

選擇掩蔽劑的原則是：掩蔽劑不與待測組分反應；掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應產(chǎn)物不干擾待測組分的測定。例：測定Ti4＋，可加入H3PO4掩蔽劑使Fe3+(黃色)成為Fe(PO４)23-(無色)，消除Fe3+的干擾；又如用鉻天菁S光度法測定Al3+時，加入抗壞血酸作掩蔽劑將Fe3+還原為Fe2+，消除Fe3+的干擾。1、控制酸度2、加入掩蔽劑3、選擇合適的條件（濃度、波長）4、分離干擾離子六、干擾離子的影響及清除方法第29頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三

參比溶液用來調(diào)節(jié)儀器的零點，并可以消除某些比色分析的誤差，測得的的吸光度真正反映待測溶液吸光強度。

參比溶液的選擇一般遵循以下原則：⑴若僅待測組分與顯色劑反應產(chǎn)物在測定波長處有吸收，其它所加試劑均無吸收，用純?nèi)軇ㄋ?作參比溶液；⑵若顯色劑或其它所加試劑在測定波長處略有吸收，而試液本身無吸收，用“試劑空白”(不加試樣溶液)作參比溶液；⑶若待測試液在測定波長處有吸收，而顯色劑等無吸收，則可用“試樣空白”(不加顯色劑)作參比溶液；⑷若顯色劑、試液中其它組分在測量波長處有吸收，則可在試液中加入適當掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑，作為參比溶液。七、選擇合適的參比溶液第30頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三第四節(jié)分光光度計的基本構(gòu)造和使用流程一、基本構(gòu)造光源單色器吸收池檢測器顯示0.575光源單色器吸收池檢測器顯示第31頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三1、光源----有熱輻射光源和氣體放電光源兩類要求：在可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命?？梢姽鈪^(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在350～1250nm。它是比色計和分光光度計的光源。紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射150～400nm的連續(xù)光譜。它是紫外分光光度計的光源。儀器自動控制或手動選擇單色光波長。第32頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三常用的色散元件有棱鏡和光柵兩種。棱鏡有玻璃和石英兩種材料。它們的色散原理是依據(jù)不同的波長光通過棱鏡時有不同的折射率而將不同波長的光分開。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱鏡只能用于350~3200nm的波長范圍，即只能用于可見光域內(nèi)。石英棱鏡可使用的波長范圍較寬，可從185~4000nm，即可用于紫外、可見和近紅外三個光區(qū)。光柵是利用光的衍射與干涉作用制成的，它可用于紫外、可見及紅外光域，而且在整個波長區(qū)具有良好的、幾乎均勻一致的分辨能力。2、單色器單色器是能從光源輻射的復合光中分出單色光的光學裝置，其主要功能：產(chǎn)生光譜純度高的光波且波長在紫外可見區(qū)域內(nèi)任意可調(diào)。通常由準直鏡（聚光鏡）、色散元件、狹縫組成。第33頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。（注意；每次使用要清洗干凈，或者潤洗。）3、吸收池第34頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三利用光電效應將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。4、檢測器光電池----用半導體材料制成的光電轉(zhuǎn)換器。用得最多的是硒光電池。第35頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三光電管的工作原理---將光強度信號轉(zhuǎn)換成電信號當一定強度的光照射到陰極上時，光敏物質(zhì)要放出電子，放出電子的多少與照射到它的光的大小成正比，而放出的電子在電場的作用下要流向陽極，從而造成在整個回路中有電流通過。而此電流的大小與照射到光敏物質(zhì)上的光的強度的大小成正比。這就是光電管產(chǎn)生光電效應的原理。光電倍增管----非常靈敏的光電器件，可以把微弱的光轉(zhuǎn)換成電流。其靈敏度比前2種都要高得多。它是利用二次電子發(fā)射以放大光電流，放大倍數(shù)可達到108倍。第36頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三5、信號指示系統(tǒng)（檢流計、數(shù)字顯示或自動記錄裝置）很多型號的分光光度計裝配有微處理機，一方面可對分光光度計進行操作控制，另一方面可進行數(shù)據(jù)處理。第37頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三二、分光光度計類型1、簡易分光光度計721型分光光度計722型分光光度計第38頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三

2、紫外-可見分光光度計第39頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三紫外分光光度法-----利用被測物質(zhì)的分子、離子以及有機化合物中的官能團（主要為具有不飽和鍵和未成對電子的基團。如：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—）對紫外光選擇性吸收的特性而建立起來的方法。第40頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三1、光源

鎢燈或鹵鎢燈——可見光源350~1000nm。氫燈或氘燈——紫外光源200~360nm。第41頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三2、吸收池玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)。石英——不能吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)。要求：匹配性（對光的吸收和反射應一致）第42頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三3、單色器色散元件棱鏡——對不同波長的光折射率不同分出光波長（不等距）。光柵——衍射和干涉分出光波長（等距）。4．檢測器將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕难b置。光電池、光電管（紅敏和藍敏）、光電倍增管、二極管陣列檢測器。第43頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三三、儀器使用基本流程1、檢查儀器停止狀態(tài)2、接通電源，打開儀器開關(guān)3、調(diào)節(jié)波長

穩(wěn)定約20min4、儀器調(diào)零和調(diào)滿5、選擇合適的吸收池、參比溶液6、試樣放入7、測量、讀數(shù)、記錄8、關(guān)機第44頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三第五節(jié)分光光度分析方法二、定量分析方法一、定性分析方法1、標準曲線法2、比較法3、增量法（標準加入法）4、示差法第45頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三測量有色溶液的吸光度后，常用工作曲線或比較法確定其濃度。1、標準曲線法

繪制A-C工作曲線配制一系列不同含量的待測組分的標準溶液，以不含待測組分的空白溶液為參比，測定標準溶液的吸光度。并繪制吸光度—濃度曲線，得到標準曲線（工作曲線），然后再在相同條件下測定試樣溶液的吸光度。由測得的吸光度在曲線上查得試樣溶液中待測組分的濃度，最后計算得到試樣中待測組分的含量。此法適合所測吸光度皆在0.2-0.7范圍內(nèi)的有色溶液第46頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三0.710mg/25mL蘆丁含量測定：取樣品3mg稀釋至25mL。第47頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三2、比較法

同一強度的單色光，通過兩個厚度相同而濃度不同的有色溶液時，則兩溶液濃度之比等于其吸光度之比。若標準溶液的濃度是已知的，通過計算，可以得到試樣的濃度。設(shè)：待測溶液濃度為cx，標準溶液濃度為cs。則：

Ax=εb

cx

As=εbcs得：Ａx/Ａs=εbcx/εb

cs=cx/cs此法適用于所測溶液濃度與標準溶液濃度相近時第48頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三把未知試樣溶液分成體積相同的若干份，除其中的一份不加入待測組分的標準物質(zhì)外，在其它幾份中都分別加入不同量的標準物質(zhì)。然后測定各份試液試液的吸光度并繪制吸光度對加入的標準物質(zhì)的濃度（增量）作圖，得一標準曲線：由于每份溶液中都含有待測組分，因此，標準曲線不經(jīng)過原點。將標準曲線外推延長至與橫坐標交于一點，則此點到原點的長度所對應的濃度值就是待測組分的濃度。3、增量法（標準加入法）此法的優(yōu)點是：自動扣除背景吸收第49頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三y2=k(x+x0)+bx0xy第50頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三普通分光光度法一般只適于測定微量組分，當待測組分含量較高時，將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差法。即提高入射光強度，并采用濃度稍低于待測溶液濃度的標準溶液作參比溶液。

設(shè)：待測溶液濃度為cx，標準溶液濃度為cs(cs<cx)。則：

Ax=εbcx

As=εbcsΔＡ＝Ａx－Ａs=εb(cx－cs）=εbΔc

測得的吸光度相當于普通法中待測溶液與標準溶液的吸光度之差ΔＡ。4、示差法此法適合組分含量高的有色溶液第51頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三示差法測得的吸光度與Δc呈直線關(guān)系。由標準曲線上查得相應的Δc值，則待測溶液濃度cx

：cx=cs+Δc

普通法：cs的T=10%；cx的T=5%

示差法：cs

做參比，調(diào)T=100%

則：cx的T=50%；標尺擴展10倍第52頁，講稿共59頁，2023年5月2日，星期三第六節(jié)分光光度計的維護與保養(yǎng)第七節(jié)數(shù)據(jù)處理----線性回歸分析法簡介一、標準曲線回歸法使用最小二乘法確定的直線稱為回歸線，表達式為：