細(xì)胞培養(yǎng)工程細(xì)胞培養(yǎng)基詳解演示文稿

細(xì)胞培養(yǎng)工程細(xì)胞培養(yǎng)基詳解演示文稿本文檔共34頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分（優(yōu)選）細(xì)胞培養(yǎng)工程細(xì)胞培養(yǎng)基本文檔共34頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分3細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)過程的兩個(gè)階段細(xì)胞擴(kuò)增（與化學(xué)過程催化劑角色相似）產(chǎn)物形成（蛋白質(zhì)表達(dá)）或細(xì)胞分化（細(xì)胞治療）不同階段分別優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)過程優(yōu)化充分了解細(xì)胞的生理需要和代謝特點(diǎn)生長培養(yǎng)基與生產(chǎn)培養(yǎng)基分別優(yōu)化結(jié)合生物反應(yīng)器操作，操縱細(xì)胞生長與代謝行為，使過程效益（或效率）最大化細(xì)胞生長環(huán)境優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院本文檔共34頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分在體內(nèi)，細(xì)胞與血液不直接接觸，物質(zhì)交換依賴于龐大的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)與細(xì)胞間質(zhì)中的擴(kuò)散過程胞間質(zhì)濃度（mM）胞內(nèi)濃度（mM）Na+14014K+4.0140Ca2+1.20.01Mg2+0.720Cl-1084HCO3-28.310HxPO4y-211SO42-0.51Aminoacids28Lactate1.21.5Glucose56Protein24TotalChemicals(mM)301.8302.2CorrectedOsmolarity(mM)281.3281.3體內(nèi)細(xì)胞間質(zhì)的化學(xué)環(huán)境Source:CellCultureBioprocessEng.pp100細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院本文檔共34頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分5生物體液血清血漿胚胎提出物淋巴液蛋白質(zhì)水解物天然培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院本文檔共34頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分6現(xiàn)代培養(yǎng)基類型細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院基底培養(yǎng)基（BasalMedia）糖氨基酸脂肪酸，脂類前體維生素，核苷類普通鹽類，微量元素pH緩沖體系添加物（Supplements）血清生長因子/載體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)水解物（含）血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基（Serum-freemedia）本文檔共34頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分7培養(yǎng)基比較細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院復(fù)合（血清）培養(yǎng)基

（Complexmedia）血清含量可占到20%成分非完全確定血清植物蛋白質(zhì)水解物大豆磷脂化學(xué)定義培養(yǎng)基（Chemicallydefinedmedia）所有成分明確可能含有基因工程表達(dá)的蛋白質(zhì)多肽生長因子細(xì)胞因子載體蛋白本文檔共34頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分8培養(yǎng)基比較細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院無血清培養(yǎng)基（Serum-freemedia）不含血清成分完全確定成分非完全確定植物蛋白質(zhì)水解物大豆磷脂無動(dòng)物成分培養(yǎng)基（Animalcomponent-freemedia)所有成分明確可能含有生長因子細(xì)胞因子載體蛋白為了避免動(dòng)物病毒或朊蛋白污染，無血清培養(yǎng)基或無動(dòng)物成分培養(yǎng)基已經(jīng)成為工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，貫穿細(xì)胞庫構(gòu)建和生產(chǎn)過程。本文檔共34頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分9培養(yǎng)基比較細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院無蛋白培養(yǎng)基（Protein-freemedia）不含血清不含任何蛋白質(zhì)成分成分可能含有蛋白質(zhì)水解物非成分明確脂類或脂肪酸本文檔共34頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)成分F12DMEMD/F12(1:1)CaCl2CaCl2·2H2OCa(NO3)2·4H2OCuSO4·5H2OFeSO4·7H2OFe(NO3)3·9H2OKClMgSO4MgCl2MgCl2·6H2ONaClNaHCO3NaH2PO4·H2ONa2HPO4Na2HPO4·12H2OZnSO4·7H2O33.220.00240.830.10223.6057.22759911761420.8620040097.6764003700125116.60.00130.4170.05311.848.8428.646995.5243862.571.020.43化學(xué)成分F12DMEMD/F12(1:1)丙氨酸精氨酸·H2O天冬氨酸天冬酰胺·H2O半胱氨酸·HCl·H2O胱氨酸胱氨酸·2HCl谷氨酸谷氨酰胺甘氨酸組氨酸·HCl·H2O羥脯氨酸異亮氨酸亮氨酸賴氨酸·HCl蛋氨酸苯丙氨酸脯氨酸絲氨酸蘇氨酸色氨酸酪氨酸酪氨酸·2Na·2H2O纈氨酸8.9021113.315.0135.1214.71467.521413.136.54.5534.510.511.927.8111.7846358430421051051463066429516104944.45147.56.657.5017.5631.297.3536518.7531.4854.4759.0591.2517.2435.4817.2526.2553.459.0255.7952.85化學(xué)成分F12DMEMD/F12(1:1)氯化膽堿葡萄糖還原型谷胱甘肽HEPES次黃嘌呤（Na）i-肌醇亞油酸硫辛酸酚紅腐胺·2HCl丙酮酸（Na）胸苷1418024.77180.0840.211.20.1611100.74.045007.2158.9831512.3912.60.0420.1058.10.081550.365化學(xué)成分F12DMEMD/F12(1:1)對(duì)氨基苯甲酸生物素泛酸鈣葉酸煙酰胺吡哆醛·HC1吡哆醇·HCl核黃素硫胺素·HCl維生素

B120.00730.51.30.0360.060.0370.31.44.04.04.04.00.44.00.00352.242.652.022.00.030.222.170.68基底培養(yǎng)基（mg/L）本文檔共34頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分11基底培養(yǎng)基成分分類細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院計(jì)量性消耗大部分基底培養(yǎng)基成分，包括葡萄糖、氨基酸、維生素、核苷酸、脂類、脂肪酸、部分鹽類、部分生長因子消耗量與胞內(nèi)能量產(chǎn)生、細(xì)胞生長和產(chǎn)物生成呈正相關(guān)計(jì)量關(guān)系陪伴類大宗鹽類如Na+、Cl-，白蛋白以及某些生長因子胞內(nèi)能量產(chǎn)生、細(xì)胞生長和產(chǎn)物生成所需量很小本文檔共34頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院12pH值范圍多數(shù)細(xì)胞系在7.4下生長良好轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：常用指示劑-酚紅pH7.8紫色pH7.6紅色略帶藍(lán)色pH7.4紅色pH7.0橙色pH6.5黃色培養(yǎng)基的物理性質(zhì)

-pH緩沖系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生CO2和乳酸NaHCO3

緩沖系統(tǒng)生理pH區(qū)間緩沖能力差毒性小成本低HEPES緩沖系統(tǒng)pH7.2-7.6緩沖能力較強(qiáng)濃度：5-20mM成本高本文檔共34頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院13滲透壓多數(shù)細(xì)胞耐受260-320mOsm/kg人細(xì)胞漿的滲透壓：290mOsm/kg更高的滲透壓通常會(huì)使細(xì)胞生長速率減緩，但也常可使蛋白產(chǎn)物的合成速率加快培養(yǎng)基營養(yǎng)物總濃度上限測(cè)量方法Freezing-pointdepressionElevationofvaporpressure培養(yǎng)基的物理性質(zhì)–

滲透壓本文檔共34頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院14溫度溫度對(duì)細(xì)胞生長有直接作用；避免溫度過高；在離開細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境之后，最好將培養(yǎng)直接置放在碎冰上；過程開發(fā)：在細(xì)胞密度達(dá)到適合程度時(shí)，降低培養(yǎng)溫度（如30oC），阻止細(xì)胞生長但不阻止蛋白質(zhì)合成。培養(yǎng)基的物理性質(zhì)–

溫度Q:培養(yǎng)基使用前需要預(yù)熱嗎？本文檔共34頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院15表面張力和泡沫貼壁培養(yǎng)：培養(yǎng)基表面張力可促進(jìn)貼壁細(xì)胞在介質(zhì)上貼附懸浮培養(yǎng)：氣泡形成是為細(xì)胞生長提供溶氧的主要機(jī)制泡沫會(huì)使蛋白質(zhì)變性的速率增加。加入硅油消泡劑降低表面張力，有助于防止泡沫生成泡沫達(dá)到培養(yǎng)容器的頂部會(huì)增加污染的危險(xiǎn)泡沫在液面上的破碎過程是能量快速釋放的過程，會(huì)造成細(xì)胞的嚴(yán)重傷害。PluronicF68

培養(yǎng)基的物理性質(zhì)–

表面張力本文檔共34頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院16細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成（1）水培養(yǎng)基緩沖液主要污染物無機(jī)物：包括重金屬、鐵、鈣、氯等。有機(jī)物：主要是植物腐敗的副產(chǎn)物和洗滌劑。細(xì)菌：熱原。顆粒：主要是氣溶膠物質(zhì)。注射用水（Waterforinjection,WFI）水純化單元操作：過濾、活性炭吸附、超濾、蒸餾、離子交換、反滲透、紫外氧化。大規(guī)模生產(chǎn)：316L不銹鋼；高溫循環(huán)本文檔共34頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分能源和碳源物質(zhì)六碳糖及糖酵解的產(chǎn)物葡萄糖：5-20mM半乳糖：果糖：Glut-5，少數(shù)細(xì)胞種類丙酮酸：主要代謝產(chǎn)物：ATP，乳酸，CO2，

TCA循環(huán)谷氨酰胺：2-6mM消耗量相當(dāng)于葡萄糖的10-20%蛋白質(zhì)合成為核苷合成提供氨基經(jīng)-酮戊二酸進(jìn)入TCA循環(huán)脫氨反應(yīng)水溶液自分解血清具有谷氨酰胺酶活性細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成（2）Glut-1，大多數(shù)細(xì)胞種類本文檔共34頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院18細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成（3）氨基酸：蛋白質(zhì)合成、含氮化合物的前體，能源。必需氨基酸：細(xì)胞無法自我合成；谷氨酰胺：細(xì)胞能量代謝、蛋白質(zhì)合成；若干其它氨基酸：可能12種，必須從培養(yǎng)基中攝取。非必需氨基酸：其余7種氨基酸可在細(xì)胞內(nèi)自己合成，或通過轉(zhuǎn)氨作用由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來；對(duì)谷氨酰胺的利用量通常超過其它必需氨基酸的總和；丙氨酸常是被大量生成的氨基酸（谷氨酰胺代謝）；各種細(xì)胞對(duì)氨基酸的種類和濃度有不同的要求，對(duì)氨基酸的利用也有差別，但除了谷氨酰胺外，通常亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸的利用量較大；脯氨酸為重組CHO細(xì)胞所特需，天冬酰胺為某些腫瘤細(xì)胞系所必需；甘氨酸有時(shí)在葉酸缺乏或甲氨蝶呤和氨基蝶呤存在下需要，絲氨酸常在克隆密度下所必需；具體氨基酸利用情況需要通過氨基酸分析（HPLC）結(jié)果決定，不要被必需/非必需氨基酸生化定義所誤導(dǎo)。本文檔共34頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院19細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成（4）維生素維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)的重要生物活性化合物，在細(xì)胞中多以酶的輔基或輔酶形式存在，對(duì)細(xì)胞的代謝過程有重要影響。水溶性維生素：生物素、葉酸、煙酰胺、吡哆醛（醇）、泛酸、核黃素、硫胺素、維生素B12、維生素C、對(duì)氨基苯甲酸等。脂溶性維生素：維生素A、維生素D、維生素E、維生素K等溶解方法：先高濃度溶于有機(jī)溶劑如酒精維生素的用量因細(xì)胞而異，但通常培養(yǎng)基中的量已經(jīng)能夠滿足大多數(shù)細(xì)胞系的需要。本文檔共34頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院20細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成（5）無機(jī)離子大宗離子常見：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、HPO4-、SO42-Na+/K+：細(xì)胞膜電位Na+/CI-：維持滲透壓平衡Mg2+：酶反應(yīng)的輔因子Mg2+/Ca2+

：細(xì)胞貼附HPO4-/HCO3-:緩沖作用微量元素常見：鐵、錳、鋅、鉬、硒、釩、銅其它：無蛋白長期培養(yǎng)往往需要鈷、鋯、鍺、鎳、錫、鉻、鋁、鋰、溴、碘、硼、氟、硅、鈦、銣、銀、鋇等。試劑等級(jí)化學(xué)品和添加劑中普遍存在污染物和雜質(zhì)藥典級(jí)如USP分析純本文檔共34頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院21細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成（6）脂類和磷脂前體有血清細(xì)胞培養(yǎng)：脂類來自于血清無血清/無蛋白培養(yǎng)：需要添加脂類如膽固醇、脂肪酸、磷脂。膽堿：卵磷脂合成前體乙醇胺：腦磷脂合成前體肌醇：肌醇磷脂合成前體核酸前體核酸(RNA/DNA)前體通常不是培養(yǎng)基的必需成分缺陷型CHO細(xì)胞：葉酸不足，添加嘌呤類（腺嘌呤和次黃嘌呤）和胸腺嘧啶有益于細(xì)胞生長。本文檔共34頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院22細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成（7）非營養(yǎng)性物質(zhì)

調(diào)節(jié)細(xì)胞的物理化學(xué)環(huán)境，間接影響細(xì)胞行為；抗生素：對(duì)細(xì)胞生長有不利影響，盡量避免；pH緩沖劑：碳酸氫鈉：常用26mM，與5-10%CO2平衡；

HEPES：10-50mM，更高會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性。pH指示劑：酚紅商業(yè)化生產(chǎn)不予采用本文檔共34頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分血

清主要類型胎牛血清（Fetalbovineserum）小牛血清（Calfserum）馬血清（Horseserum）人血清（Humanserum）主要作用促進(jìn)細(xì)胞貼壁，多數(shù)原代細(xì)胞及許多細(xì)胞株具有貼壁生長要求；刺激細(xì)胞生長與細(xì)胞分裂；細(xì)胞營養(yǎng)來源；對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)23本文檔共34頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分血清成份（1）蛋白質(zhì)白蛋白（Albumin）：轉(zhuǎn)運(yùn)（如脂類）、緩沖與保護(hù)功能纖維連接蛋白（Fibronectin）：細(xì)胞貼壁胎球蛋白（Futuin）：細(xì)胞貼壁（不是甲胎蛋白）巨球蛋白（2-Macroglobulin）：抑制胰蛋白酶

Transferrin（轉(zhuǎn)鐵蛋白）：與鐵結(jié)合，使其失去毒性并轉(zhuǎn)運(yùn)抗體與補(bǔ)體（Antibodies&complements）：多肽類血小板衍生生長因子（Platelet-derivedgrowthfactor，PDGF）胰島素類生長因子（Insulin-likegrowthfactor，IGFI/II）成纖維細(xì)胞生長因子（Fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF）上皮細(xì)胞生長因子（Epidermal

growthfactor，EGF）細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院24本文檔共34頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分激素胰島素（Insulin）：葡萄糖吸收，刺激有絲分裂；氫化可的松（Hydrocortisone）：貼壁，生長，分化；代謝產(chǎn)物與營養(yǎng)物氨基酸葡萄糖酮酸許多其他營養(yǎng)物和中間代謝物礦物質(zhì)類血清蛋白：微量元素和鐵、銅和鋅硒：與還原型谷胱甘肽一起發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)細(xì)胞抑制劑細(xì)菌毒素細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院25血清成份（2）本文檔共34頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分取血（Bloodcollection）減少供體動(dòng)物痛苦；無菌操作；自然凝血（Naturalclotting,4oC）血小板細(xì)胞釋放關(guān)鍵生長因子，如

PDGF；離心去除較大固體物質(zhì)；過濾：去除顆粒性物質(zhì)，最終達(dá)到無菌微生物污染，包括支原體和噬菌體；膜過濾：1.2、0.8、0.65、0.45、0.22、0.1微米；0.1微米多次。血清的制備方法細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院26本文檔共34頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分特殊血清透析血清（Dialyzedserum）采用膜透析（生理鹽水），去除干擾小分子化合物活性炭/葡聚糖處理胎牛血清（Charcoal/dextrantreatedFBS）降低類固醇激素含量如黃體酮降低血清批次間差異熱滅活血清（Heatinactivatedserum）血清中補(bǔ)體成分造成干擾30minutesoftreatmentat56oC（水?。│?射線輻射降低血清中潛在病毒濃度106

倍27Source：細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院本文檔共34頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分篩選品種和批次之間存在生物活性差異；購買前，應(yīng)針對(duì)支持細(xì)胞生長的能力進(jìn)行篩選；篩選后，備足夠數(shù)量以供長期使用。冷凍儲(chǔ)藏保持血清成分的生物活性；分裝凍存解凍：2-8oC，期間輕輕混勻以減少蛋白質(zhì)沉淀；解凍后，無菌操作，分裝50毫升無菌離心管；-80oC凍存。注意事項(xiàng)血清的儲(chǔ)藏細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院28本文檔共34頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分血清質(zhì)量證明CertificatesofAnalysis:FiltrationstatementCountryoforiginCellgrowthperformancetestingMicrobialsterilitytestingScreening:mycoplasmavirusendotoxinhaemoglobinIgGtotalprotein29細(xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院本文檔共34頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分血清的主要問題血清原料來源有限血清批次之間生物活性差異較大血清是蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)的主要原料成本之一蛋白質(zhì)藥物純化成本一般占蛋白質(zhì)生產(chǎn)的總成本的50%以上血清會(huì)引入大量雜質(zhì)蛋白質(zhì)（如IgG），大幅度增加純化難度和成本BSA：過敏反應(yīng)，藥典安全水平≦50ng/劑量潛在生物污染病毒朊蛋白（瘋牛?。┘?xì)胞培養(yǎng)工程南開大學(xué)藥學(xué)院30血清對(duì)細(xì)胞的負(fù)面作用抗體交叉反應(yīng)干擾本文檔共34頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\5點(diǎn)21分胰島素vs胰島素樣生長因子-1（IGF-1）胰島素對(duì)許多細(xì)胞類型有調(diào)控葡萄糖吸收的作用；在較高濃度時(shí)，通過與IGF-1共享信號(hào)傳導(dǎo)通路，胰島素