細胞因子的檢測和應用

發(fā)展歷史和命名

1966年-巨噬細胞移動抑制因子1969年提出了“淋巴因子”的概念此后，又提出了“單核因子”的概念(由于如此眾多的免疫活性因子的發(fā)現(xiàn)，且鑒于對其本質(zhì)尚不清楚，均以其生物學活性命名，致使這些因子的名稱相當混亂。)1979年在瑞士召開的第二屆淋巴因子國際會議上提出了白細胞介素的概念,并按發(fā)現(xiàn)順序以阿拉伯數(shù)字排列。尚有其它細胞分泌的活性介質(zhì)，如IFN-α和IFN－β分別由白細胞和纖維母細胞產(chǎn)生。目前將所有這些因子統(tǒng)稱為細胞因子。

本文檔共42頁；當前第1頁；編輯于星期一\18點44分概述

概念細胞因子（cytokine）是指由活化的免疫細胞（包括淋巴細胞和非淋巴細胞）和某些基質(zhì)細胞分泌的、介導和調(diào)節(jié)免疫應答及炎癥反應的小分子多肽類因子，它們是除免疫球蛋白和補體之外的另一類非特異性免疫效應物質(zhì)

。產(chǎn)生細胞因子的細胞種類很多，但歸納起來主要有三類：①活化的免疫細胞，包括淋巴細胞、單核／巨噬細胞、大顆粒淋巴細胞、粒細胞、肥大細胞等；②基質(zhì)細胞類，包括骨髓和胸腺的基質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、纖維母細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞等；③某些腫瘤細胞系。產(chǎn)生：抗原、致分裂原、感染、炎癥等多種因素可刺激細胞因子的產(chǎn)生，各細胞因子之間也有相互刺激合成和分泌的作用。

本文檔共42頁；當前第2頁；編輯于星期一\18點44分共同特點

1)正常休止狀態(tài)的細胞必須經(jīng)刺激和活化后才能合成和分泌CKs,細胞內(nèi)無細胞因子前體儲存,接受刺激后從激活基因開始至合成,分泌,刺激結(jié)束后細胞因子的產(chǎn)生隨即停止.。2）絕大多數(shù)CKs均為低分子量（4～80kD）的糖蛋白。3）分泌特性：大多數(shù)的CKs是通過旁分泌（paracrine），或自分泌（autocrine），少部分通過內(nèi)分泌的形式作用于遠處靶細胞或靶器官；4）多樣性：一種細胞可產(chǎn)生多種細胞因子，不同類型細胞也可產(chǎn)生一種或幾種相同的細胞因子。

5）網(wǎng)絡性：協(xié)同效應；重疊效應；拮抗效應。

6）高效性：它們的受體親和力高，表現(xiàn)很強的生物學活性，是免疫球蛋白等分子遠不能及的。7)非特異性:細胞因子多由免疫細胞在特定抗原或絲裂原刺激下所產(chǎn)生,但其對靶細胞發(fā)揮功能卻為非特異性,也不受MHC限制.本文檔共42頁；當前第3頁；編輯于星期一\18點44分3．分類白細胞介素（interferon）IL干擾素（interferon）IFN腫瘤壞死因子（TNF）集落刺激因子（CSF）生長因子（growfactor）GF趨化因子本文檔共42頁；當前第4頁；編輯于星期一\18點44分細胞因子檢測受體檢測技術

生物學細胞增殖靶細胞殺傷

趨化活性誘導產(chǎn)物細胞病變抑制分子生物學DNARNA檢測ELISA免疫學流式細胞技術本文檔共42頁；當前第5頁；編輯于星期一\18點44分生物學檢測法

(1)細胞增殖法依賴細胞株：許多細胞因子具有細胞生長因子活性，利用這一特性，現(xiàn)已篩選出一些對特定細胞因子起反應的細胞，并建立了只依賴于某種因子的細胞系，即依賴細胞株（簡稱依賴株）。這些依賴株在通常情況下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依賴株CTLL-2在不含IL-2的培養(yǎng)基中很快死亡，而加入IL-2后則可在體外長期培養(yǎng)。在一定濃度范圍內(nèi)，細胞增殖與IL-2量成正比。除依賴株外，還有一些短期培養(yǎng)的細胞，如胸腺細胞、骨髓細胞、促有絲分裂原刺激后的淋巴母細胞等，均可作為靶細胞來測定某種因子活性。

本文檔共42頁；當前第6頁；編輯于星期一\18點44分3H-TdR摻入法原理：將3H-TdR作為DNA合成的原料摻入到新增殖的細胞中，細胞DNA合成的增加或減少而間接判斷細胞增殖的方法，而用放射物質(zhì)標記的胸腺嘧啶則可代表細胞DNA的增值程度，通過與細胞因子標準品比較，而推算出待測標本中細胞因子的含量。本文檔共42頁；當前第7頁；編輯于星期一\18點44分步驟：1．依賴細胞株的培養(yǎng)。用血細胞計數(shù)儀測定細胞密度，取適當體積的細胞用于測定。用基礎培養(yǎng)液洗細胞兩次后，測定細胞活力（應>80%），并以測定培養(yǎng)液重懸細胞至合適終濃度用以測定。表１５－１提供了參考。２．用細胞因子標準品建立一個標準曲線，并設置已知含測定培養(yǎng)液的質(zhì)控孔。３．適當稀釋待測標本，加入微孔板中雙份重復測定。４．每孔中加入細胞懸液，置于濕潤的CO2培養(yǎng)箱中３７℃培養(yǎng)。（培養(yǎng)時間按所用細胞株而定）５．加入3H標記的胸腺嘧啶，在置于CO2培養(yǎng)箱中３７℃培養(yǎng)約4h。６．收集細胞于玻璃纖維濾紙上，是用液體閃爍儀測定放射活性。此方法優(yōu)點是易于自動化，測定的信噪比最好，可常規(guī)用于大標本量的測定。缺點是使用放射性核素，試驗廢物處理麻煩。本文檔共42頁；當前第8頁；編輯于星期一\18點44分MTT法

MTT（四唑鹽）比色法是一種檢測細胞存活和增殖的方法，所用的顯色劑是一種能接受氫原子的化合物MTT。原理是，活細胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的MTT還原為藍紫色的結(jié)晶formazan，后者的產(chǎn)量與活細胞數(shù)成正相關。formazan可用DMSO、無水乙醇或酸化異丙醇等溶解，在酶標儀上以波長620nm進行比色。所檢測的OD值的大小可反應細胞代謝活性的強弱。優(yōu)點：靈敏度高，操作簡便，自動化。缺點：影響因素多，重復性較差。注意：MTT有毒性致突變性，操作時應注意防護。本文檔共42頁；當前第9頁；編輯于星期一\18點44分(2)靶細胞殺傷法

根據(jù)某些細胞因子（如TNF）能在體外殺傷靶細胞而設計的檢測方法。通常靶細胞多選擇體外長期傳代的腫瘤細胞株，利用同位素方法或顏料染色等方法判定細胞的殺傷率。一般活細胞的檢測可采用染料甲紫、萘酚藍黑、MTT等使細胞著色，再用脫色液將燃料脫出，然后用酶標儀比色來反映細胞存活狀態(tài)。本文檔共42頁；當前第10頁；編輯于星期一\18點44分培養(yǎng)孔特定細胞株加入TNF37℃MTT酶標儀比色吸光度與細胞因子的量成反比，用細胞因子標準品稀釋度作線性曲線，便可得到特定細胞因子的含量。本文檔共42頁；當前第11頁；編輯于星期一\18點44分

(3)趨化活性測定法本法主要用于趨化因子和IL-8的生物學活性測定。趨化性細胞因子主要由白細胞與造血微環(huán)境中的基質(zhì)細胞分泌，可結(jié)合在內(nèi)皮細胞的表面，具有對中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞的趨化性（chemotaxis）和化學增活性（chemokinesis）。趨化性指趨化因子誘導細胞有趨化因子濃度低的地方向濃度高的地方移動的特性，可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗測定；化學增活性是指其增強細胞運動能力的特性，可采用瓊脂糖小滴化學動力學實驗測定。本文檔共42頁；當前第12頁；編輯于星期一\18點44分3~5μm孔徑的微孔濾膜靶細胞濾液受檢的趨化因子３７℃溫育數(shù)小時取膜固定、干燥、著染、脫色將透明后的濾膜置油鏡下檢測細胞在膜內(nèi)通過距離，求其趨化單位濾膜微孔小室法本文檔共42頁；當前第13頁；編輯于星期一\18點44分細胞懸液對照培養(yǎng)液趨化因子或待測液將含小牛血清的1%瓊脂糖傾于平皿，如上圖操作后經(jīng)３７℃溫育后，用2%戊二醛固定，除去瓊脂糖層，經(jīng)染色后，測量細胞運動的距離，計算移動指數(shù)。移動指數(shù)=趨化移動距離/任意移動距離瓊脂糖平板法本文檔共42頁；當前第14頁；編輯于星期一\18點44分

(4)細胞因子誘導的產(chǎn)物分析法某些細胞因子可刺激特定細胞產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，如IL-2誘導骨髓細胞合成組胺、IL-6誘導肝細胞合成a1-抗胰蛋白酶等。通過測定所誘生的相應產(chǎn)物，可反映細胞因子的活性(5)細胞病變抑制法

病毒可造成靶細胞的損傷，干擾素等則可抑制病毒所導致的細胞病變，因此可利用細胞病變抑制法檢測這類因子。本文檔共42頁；當前第15頁；編輯于星期一\18點44分免疫學檢測法

細胞因子均為蛋白或多肽，具有較強的抗原性。隨著重組細胞因子的出現(xiàn)，可較方便制得細胞因子的特異性抗血清或單克隆抗體，因此盡管細胞因子的種類繁多，只要獲得了針對某一因子的特異性抗體（包括多克隆抗體或單克隆抗體）均可采用相似的技術開展工作。常用的方法有ELISA、RIA及免疫印跡法等。目前，幾乎所有常見細胞因子的檢測試劑盒均有商品供應。本文檔共42頁；當前第16頁；編輯于星期一\18點44分流式細胞技術

flowcytometry

可以測定單個細胞因子產(chǎn)生特性。原理：熒光素標記的細胞因子特異的單克隆抗體，在一定條件下，與活化的靶細胞內(nèi)的特異細胞因子結(jié)合，然后用流式細胞儀分析熒光標記的陽性細胞百分率和平均熒光強度，其與細胞內(nèi)細胞因子的含量成正比。本文檔共42頁；當前第17頁；編輯于星期一\18點44分流式細胞術檢測細胞內(nèi)細胞因子

cytokinesincellDetection

byflowcytometry

分離待測細胞活化細胞（莫能菌素（monensin)和布雷菲爾德菌素）封閉細胞表面Fc受體（脫脂奶）細胞表面抗原染色固定和通透細胞膜（多聚甲醛）細胞內(nèi)細胞因子染色流式細胞分析本文檔共42頁；當前第18頁；編輯于星期一\18點44分本文檔共42頁；當前第19頁；編輯于星期一\18點44分分子生物學檢測法

(DNA)１．提取細胞基因組的DNA，將其用限制性核酸內(nèi)切酶切，２．再做瓊脂糖凝膠電泳將酶切DNA片斷分離，３．將經(jīng)變性的DNA片斷轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，４．用相應細胞因子的核酸探針來檢測其特定DNA序列結(jié)構(gòu)?？蛇M行基因的定性及定量、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RLFP）等。SOUTHERNBLOT本文檔共42頁；當前第20頁；編輯于星期一\18點44分重物500g吸水紙濾紙轉(zhuǎn)移膜凝膠濾紙雜交緩沖液玻璃支撐Southernblot本文檔共42頁；當前第21頁；編輯于星期一\18點44分分子生物學檢測法聚合酶鏈反應（PCR）PCR可用于檢測細胞因子基因有無缺失、突變，當有缺失時則缺少擴增的DNA片斷，而當基因突變時可產(chǎn)生新的酶切位點或原有的內(nèi)切酶位點喪失，經(jīng)RLFP或PCR結(jié)合序列特異寡核苷酸探針斑點雜交分析可發(fā)現(xiàn)突變的基因，如嚴格控制雜交及洗膜條件，可發(fā)現(xiàn)單個堿基的突變；還可應用PCR結(jié)合序列特異引物及上述兩種方法檢測某些細胞因子的多態(tài)性。本文檔共42頁；當前第22頁；編輯于星期一\18點44分實時熒光PCR技術特點：實時（realtime)測定，靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測同時完成，擴增管在整個測定過程中完全處于閉管狀態(tài)，不容易出現(xiàn)擴增產(chǎn)物對實驗室的“污染”，對實驗技術人員的測定操作及實驗室設置的要求都相對要低一些。TaqMan技術“分子信標”技術本文檔共42頁；當前第23頁；編輯于星期一\18點44分TaqMan技術oCH2OPOH5’端標記報告熒光3’端標記淬滅熒光沒有雜交，距離近而發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移樣本中原始模板的數(shù)量與熒光強度超出選定閾值時的擴增循環(huán)數(shù)（Ct)成反比TaqMan聚合酶本文檔共42頁；當前第24頁；編輯于星期一\18點44分“分子信標”技術5’3’本文檔共42頁；當前第25頁；編輯于星期一\18點44分分子生物學檢測法(mRNA)Northern印跡雜交本方法有一定的限制性，因為mRNA的穩(wěn)定性及其降解速率直接影響細胞內(nèi)mRNA的積累量，因此用細胞總RNA作Northern印跡雜交，其結(jié)果不能完全反映mRNA的轉(zhuǎn)錄活性。反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）細胞因子的mRNA壽命短、拷貝數(shù)低，難以在小量樣本中進行檢測。RT-PCR能檢測細胞內(nèi)低豐度特異mRNA的方法。本文檔共42頁；當前第26頁；編輯于星期一\18點44分原位雜交將標記的特異DNA或RNA探針與細胞內(nèi)染色體上相應的DNA形成穩(wěn)定的雜交體。此法可用于細胞因子基因的組織細胞及染色體定位。原位PCR原位雜交的應用受到其敏感性的影響，而細胞因子的基因均為單拷貝，有時不能被檢出。原位PCR就是以特定的DNA或RNA為模板，在細胞核內(nèi)原位進行擴增。而擴增產(chǎn)物因分子較大，或互相交織，不宜透過細胞膜而保留在原位。在應用原位雜交技術將其檢出。本文檔共42頁；當前第27頁；編輯于星期一\18點44分細胞因子受體檢測技術

細胞因子的生物學活性是通過其相應的受體發(fā)揮作用的，細胞因子受體檢測已成為基礎和臨床免疫學研究的重要內(nèi)容。本節(jié)主要介紹細胞因子受體檢測的基本方法?；罴毎赵囼瀸⑦^量的待測細胞與有限的細胞因子共育，若細胞膜表面存在相應的受體即可吸收細胞因子，通過測定回收后細胞因子生物活性喪失情況可確定受體是否存在。此法簡便，適用于定性。本文檔共42頁；當前第28頁；編輯于星期一\18點44分細胞因子受體檢測技術放射性核素標記重組配體的放射受體分析本方法是確定細胞受體分布及其特性的主要方法，可測定受體的數(shù)量及親和力。通常采用放射性核素示蹤，如體外標記重組細胞因子，通過生物合成的標記重組細胞因子的功能不受影響，受體單克隆抗體標記分析技術抗細胞因子受體的McAb既可封閉受體抑制相應細胞因子的生物活性，也可用標記的McAb直接做免疫放射受體分析或免疫共沉淀。本文檔共42頁；當前第29頁；編輯于星期一\18點44分細胞因子受體檢測技術受體cDNA分析酶免疫技術檢測法某些細胞因子受體除存在于細胞膜外，尚可分泌進入體液，稱為可溶性細胞因子受體（solublecytokinereceptor）,如sIL-2R、sIL-4R和sIFN-γR。這類受體多采用ELISA法檢測。重組細胞因子與受體的交聯(lián)分析利用化學交聯(lián)劑將標記的重組細胞因子與膜受體交聯(lián)，細胞裂解物經(jīng)PAGE電泳后作放射自顯影分析，通過帶型分析可確定受體的分子量及亞單位。本文檔共42頁；當前第30頁；編輯于星期一\18點44分三種細胞因子測定方法的比較

生物學檢測法：比較敏感，直接測定生物學功能，可靠，但需培養(yǎng)依賴性細胞株、耗時長、步驟繁，影響因素多，不易掌握。免疫學檢測法：操作較簡便、快速、重復性好、尚可測定特定細胞或亞群產(chǎn)生細胞因子的含量，但敏感度比生物學法低10~100倍。免疫學檢測法檢測的是細胞因子蛋白質(zhì)的抗原性，可能是無活性的變性分子或細胞因子的裂解片斷。分子生物學檢測法：只能代表基因表達情況，不能提供細胞因子的濃度及活性等資料。本文檔共42頁；當前第31頁；編輯于星期一\18點44分生物學活性法免疫學檢測法原理生物學活性水平特異性結(jié)合反應敏感性一般較高(受體)一般較低(加放大系統(tǒng)可明顯升高)特異性低高(識別類型、亞型)(不能)(有可能)周期較長短培養(yǎng)條件大小指示細胞敏感性差異大/指示細胞突變可發(fā)生/生物學作用相同因子擾大小樣品中特異性或非特異性抑制物干擾大小重復性較差較好標準化、大量檢測困難容易本文檔共42頁；當前第32頁；編輯于星期一\18點44分細胞因子測定的臨床應用原則應使用多種方法測定測定標本選擇適當（血液、局部炎癥分泌物、細胞、疾病的動態(tài)觀察）同時測定多種細胞因子（了解T細胞、巨噬細胞、和上皮樣細胞分泌細胞因子的功能）本文檔共42頁；當前第33頁；編輯于星期一\18點44分細胞因子測定的臨床應用特定疾病的輔助診斷評估機體的免疫狀態(tài)臨床疾病的治療應用臨床疾病的預防應用本文檔共42頁；當前第34頁；編輯于星期一\18點44分細胞因子測定的臨床應用現(xiàn)狀雖然已知較多的細胞因子，但僅僅少數(shù)用于臨床常規(guī)檢查，如IL-6、IL-8、TNF-α。由于細胞因子的基因多效性和復雜性，并無哪一種細胞因子能作為某一特定疾病的標志。由于某一細胞因子穩(wěn)態(tài)的漂移和疾病的特異性損傷有關，因此對于評價一種疾病的活動狀況是非常重要的新生兒敗血癥患者出生后幾小時，IL-6和IL-8升高，這項檢查具有較高的臨床靈敏度和特異性，而使用傳統(tǒng)的急性相蛋白如CRP則要在24~48小時才升高。測定體液中炎癥相關的細胞因子也具有臨床意義。本文檔共42頁；當前第35頁；編輯于星期一\18點44分粘附分子的檢測及應用

尹向飛本文檔共42頁；當前第36頁；編輯于星期一\18點44分細胞粘附分子（celladhesion

molecules,CAM）是眾多介導細胞間或細胞與細胞外基質(zhì)（extracellularmatrix,ECM）間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱。粘附分子以受體－配體結(jié)合的形式發(fā)揮作用，是細胞與細胞間，細胞與基質(zhì)間，或細胞－基質(zhì)－細胞間發(fā)生粘附，參與細胞的識別，細胞的活化和信號轉(zhuǎn)導，細胞的增值與分化，細胞的伸展與移動，是免疫應答、免疫發(fā)生、凝血、腫瘤