新教材選修3-2PCR技術(shù)專(zhuān)題

新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題選修1專(zhuān)題2課題2PCR技術(shù)新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題自學(xué)提綱：知識(shí)回顧：分子的結(jié)構(gòu)（外側(cè)、內(nèi)側(cè)、基本單位）；2.DNA復(fù)制過(guò)程和特點(diǎn)；技術(shù)概念及應(yīng)用。基本概念：變性、復(fù)性、TaqDNA聚合酶、引物理解PCR技術(shù)的原理掌握PCR技術(shù)的全過(guò)程比較PCR技術(shù)和體內(nèi)DNA復(fù)制的異同點(diǎn)。新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）、PCR技術(shù)的概念是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百份的DNA拷貝（二）、PCR技術(shù)的應(yīng)用遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題PCR的應(yīng)用1從藍(lán)藻里面克隆SOD(超氧化物歧化酶)清除人體內(nèi)細(xì)胞中自由基抗氧化、抗輻射、消炎、抗衰老、抗癌高壓氧中毒、肺氣腫、糖尿病、早衰食品、保健品、藥品、化妝品基因庫(kù)檢索SOD的序列設(shè)計(jì)引物以藍(lán)藻總DNA位模板做PCR獲得的基因片斷連接在表達(dá)載體原核表達(dá)蛋白新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題PCR的應(yīng)用2檢測(cè)粉末樣品是否含有炭疽桿菌炭疽菌恐慌，降臨美國(guó)，席卷全球生命力強(qiáng)、傳染快、發(fā)作快、死亡率高。有兩對(duì)引物是根據(jù)編碼炭疽桿菌EF因子的基因序列設(shè)計(jì)的，僅與各種炭疽桿菌的EF因子同源。PCR產(chǎn)物是1247bp和208bp的片斷。非炭疽桿菌均呈陰性。用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)2小時(shí)取培養(yǎng)液直接作PCR新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題PCR的應(yīng)用3基因測(cè)序新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題一、基礎(chǔ)知識(shí)（三）、PCR技術(shù)的原理新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題1、體內(nèi)DNA復(fù)制的條件：解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打開(kāi)DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化DNA子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸變性（80-100）Taq聚合酶（耐高溫）20—30個(gè)核苷酸構(gòu)成,是一小段DNA或RNAATP提供能量新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題2、DNA合成的方向（1）DNA單鏈兩端的命名①基本單位－脫氧核苷酸脫氧核糖磷酸T1號(hào)碳5號(hào)碳3號(hào)碳新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題連接ATGCATGC5，端含磷酸基團(tuán)3，端（含羥基）3，端5，端②DNA單鏈兩端的命名新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題（2）DNA聚合酶的特性DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。2、DNA合成的方向新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題（3）DNA合成的方向從子鏈由5’

端向3’端延伸新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題3、DNA復(fù)制的前提

——是______________

用_________________方法

思考：DAN復(fù)制的前提是什么？體外擴(kuò)增DNA如何打開(kāi)雙鏈？雙鏈的解開(kāi)控制溫度新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）4、DNA分子的熱變性原理：PCR儀原理變性的目的：復(fù)性的目的：解開(kāi)雙鏈有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ與兩條單鏈的結(jié)合新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題思考：高溫使DNA解旋，但普通DNA聚合酶會(huì)失活,

__________________找到耐高溫DNA聚合酶P21托馬斯.布魯克新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題5、體外DNA復(fù)制的條件(PCR

反應(yīng)的條件)①DNA模板；②分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；③四種脫氧核苷酸；④耐高溫的聚合酶；⑤控制溫度，但不需解旋酶.新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率二、PCR的反應(yīng)過(guò)程1、循環(huán)之前的一次預(yù)變性2、PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題（1）變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。（2）復(fù)性：溫度下降到50℃左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。（3）延伸：溫度上升到72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。二、PCR的反應(yīng)過(guò)程3、每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題（1）PCR循環(huán)--變性95℃變性新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題（1）PCR循環(huán)--變性95℃變性新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題（1）PCR循環(huán)--變性95℃變性新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題（2）PCR循環(huán)—復(fù)性55℃復(fù)性新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題（3）PCR循環(huán)—延伸新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題（3）PCR循環(huán)—延伸新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題（3）PCR循環(huán)—延伸新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題（3）PCR循環(huán)—延伸新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題4、循環(huán)特點(diǎn)：①上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板②結(jié)果單鏈中有最初母鏈的只兩條（無(wú)引物存于兩個(gè)子代DNA分子中③其它子代DNA分子都為雙引物分子式④處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長(zhǎng)1×2N①②練習(xí)：見(jiàn)課課練P79第10題新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題二、實(shí)驗(yàn)步驟：①準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方②用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分③蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁④離心10分鐘⑤將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序⑥電泳檢測(cè)PCR結(jié)果新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題三、操作提示：

操作提示

1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。

2．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。

3．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。目的：避免外源性DNA大量擴(kuò)增造成假陽(yáng)性反應(yīng)。新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、原理：DNA在260nm的紫外線(xiàn)波段有一強(qiáng)烈的吸收峰(圖5-11)。可以利用DNA的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測(cè)定。新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)(了解)2、具體方法如下。1）．將樣品進(jìn)行50倍稀釋?zhuān)喝?μLPCR反應(yīng)液，加入98μL蒸餾水。2）．以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)(圖5-12)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。3）．加入步驟1中的DNA稀釋液100L至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值。4）．根據(jù)下面的公式計(jì)算DNA含量。

DNA含量(μg/ml)=50x(260nm的讀數(shù))x稀釋倍數(shù)新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題五、課題延伸1、PCR優(yōu)點(diǎn)：2、PCR技術(shù)的意義原理雖然復(fù)雜，但操作卻十分簡(jiǎn)單?？焖?、高效、靈活和易于操作新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題復(fù)習(xí)：PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性；3.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題練習(xí)1、書(shū)本2、課課練新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題練習(xí)：見(jiàn)課課練P79第10題新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題9下圖為PCR過(guò)程的前三次循環(huán)的圖解，請(qǐng)據(jù)圖回答：

(])請(qǐng)將PCR緩沖液中提供的4種組分填寫(xiě)在圖中的方框內(nèi)：

(2)第一輪循環(huán)中變性是指_____________________________；復(fù)性是指__________________________________________________；延伸是指___________________________________________________。

(3)假設(shè)PGR反應(yīng)中的DNA模板為P，第一輪循環(huán)的產(chǎn)物2個(gè)子代DNA為

Nl，第二輪的產(chǎn)物4個(gè)子代DNA為N2，第二輪的產(chǎn)物8個(gè)子代DNA為

N3，則Nl、N2、N3中分別含有模板DNA單鏈的DNA分子

，

__________________、____________________個(gè)，若繼續(xù)循環(huán)36次，則N36中將有——個(gè)DNA分子含有模板DNA單鏈。

(4)N3的8個(gè)DNA分子中①②是以N2中的_____________為模板復(fù)制而來(lái)的，③④是以N2中的

為模板復(fù)制而采的，⑤⑥是以N2中的

為模板復(fù)制而來(lái)的，⑦⑧是以N2中的

為模板復(fù)制而來(lái)的。從圖中可以看出，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于2個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增，原因是____________________________________________________練習(xí)：見(jiàn)課課練P79第10題新教材選修3—2PCR技術(shù)專(zhuān)題練習(xí)二(課堂檢測(cè))1、DNA單鏈的________末端為3,端,________末端為5,端,在DNA復(fù)制時(shí),引物從模板鏈的___端配對(duì)結(jié)合.在___________酶的作用下,引物提供____端,使子鏈向下延伸.2每次循環(huán)可以分