神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病的基因診斷

基因DNA上的功能單位?；蚪Y(jié)構(gòu)模式圖：本文檔共61頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\4點22分基因突變DNA分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)變化。本文檔共61頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\4點22分突變的類型堿基替換：某個堿基被另一個堿基所取代（點突變）。嘌呤或嘧啶之間的取代為轉(zhuǎn)換；嘌呤與嘧啶之間的取代為顛換。同義突變：突變后密碼子改變但氨基酸不變化。錯義突變：突變后氨基酸發(fā)生改變。無義突變：突變后變?yōu)榻K止密碼。堿基插入和缺失：由于堿基的增多或減少造成閱讀框架的改變—移碼突變。以上突變?yōu)榉€(wěn)定突變，即傳遞中不再變化的突變。動態(tài)突變：傳遞中不斷發(fā)生變化的突變，如三聯(lián)體核苷酸數(shù)目的變化，一般是由于不等交換所致。本文檔共61頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\4點22分突變的一般特性可逆性(Aa,aA)多向性(Aa1,a2,a3,a4)有害性稀有性(Human,10-6)可重復(fù)性(Hotsite)本文檔共61頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\4點22分遺傳病由于遺傳物質(zhì)缺陷或發(fā)生改變而導(dǎo)致的機體結(jié)構(gòu)和功能的紊亂。本文檔共61頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\4點22分遺傳病的危害1、發(fā)病率逐年上升2、住院兒童近1/3為遺傳相關(guān)疾病3、自然流產(chǎn)胚胎60%有染色體畸變4、平均每人攜帶5~6個有害基因5、人群中25%患有各類不同程度的遺傳相關(guān)疾病6、絕大多數(shù)遺傳病目前沒有理想的治療方法本文檔共61頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\4點22分遺傳病的分類染色體病單基因病多基因病線粒體基因病本文檔共61頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\4點22分染色體病染色體病:染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。常染色體病的共同特征：智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形。性染色體病的共同特征：性征發(fā)育不全或畸形、智力較低。本文檔共61頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\4點22分21-三體綜合征21-三體又稱先天愚型，Down綜合征。1866年英國醫(yī)生JLHDown首先描述，1959年法國Lejeune證實該病的病因是由于G組染色體多了一條，后確定為21號。發(fā)病率：1/600~1/800。臨床表現(xiàn)：１、特殊面容—眼距寬、鼻塌平、口半開、流口水、耳廓小、手足短。２、發(fā)育不良、肌張力低、關(guān)節(jié)松弛、新生兒有第三囟門。３、部分患者有特殊膚紋，如通貫手、atd角達(dá)64(正常人41)，４、半數(shù)患者伴有先天性心臟病，白血病發(fā)病率高于正常20倍。男性基本無生育能力，女性少數(shù)可有生育能力。大部分壽命不長，少數(shù)可達(dá)50歲以上。本文檔共61頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\4點22分本文檔共61頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\4點22分單基因病單基因病：染色體上單一基因的一個或兩個等位基因突變。嚴(yán)格按照孟德爾規(guī)律遺傳臨床上最多見。本文檔共61頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\4點22分多基因病多基因病：一個或多個基因與一種或多種環(huán)境因素共同作用產(chǎn)生的疾病。沒有嚴(yán)格的孟德爾傳遞規(guī)律。病種少，但患病者多。本文檔共61頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\4點22分線粒體遺傳病線粒體遺傳病是由于mtDNA的突變所導(dǎo)致。有性生殖的方式?jīng)Q定了線粒體遺傳屬于母系遺傳。（細(xì)胞質(zhì)遺傳）

1987年首次提出線粒體病概念，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100多種疾病與線粒體DNA突變有關(guān)本文檔共61頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\4點22分線粒體遺傳病線粒體基因組編碼：2個rRNA基因和22個tRNA基因13種多肽基因：核糖體蛋白基因rps4，rps13，rps14細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體基因coxI，coxII，coxIIIATP酶復(fù)合體基因atpA1，atpA2，atpA6，atpA9，atpA10NADH脫氫酶復(fù)合體I基因：ND-1，DN-5本文檔共61頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\4點22分遺傳病大多數(shù)遺傳病為先天性疾病，但先天性疾病不一定是遺傳病。大多數(shù)遺傳病表現(xiàn)出家族聚集性，但家族性疾病不一定是遺傳病。本文檔共61頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\4點22分遺傳病診斷1、病史、癥狀、體征

病史采集、外貌特征、發(fā)育狀況。2、系譜分析

單基因，多基因；顯性，隱性；常染色體，性染色體。

表現(xiàn)度、外顯率、隔代遺傳。

遺傳方式、發(fā)病風(fēng)險。3、染色體檢查

標(biāo)本—外周血、絨毛、羊水、活檢組織。

分帶—G-,R-,C-,[熒光原為雜交(FISH)]

分析—數(shù)目（單體、多體）、結(jié)構(gòu)（易位、缺失、倒位‥)

指征—智力障礙、發(fā)育畸形、多發(fā)流產(chǎn)、不育等。

4、生化檢查

主要用于分子病和先天性代謝缺陷。5、基因診斷

直接診斷被檢者的DNA或RNA。發(fā)展最快，前景最好。

直接DNA檢測——缺失、突變、重排….。

間接遺傳標(biāo)記檢測—多態(tài)性，連鎖分析。

基因診斷技術(shù)：分子雜交、分子擴增、分子測序。本文檔共61頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\4點22分傳統(tǒng)的診斷（舉例）：１、問、望、聽、觸經(jīng)驗型診斷２、化驗/檢驗—材料：細(xì)胞、組織、大分子、小分子、代謝/排泄物等。方法：細(xì)胞學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)等。３、影像學(xué)—X光、B超、CT、核磁共振、內(nèi)窺鏡等。４、特殊檢查—染色體檢查、肌電/心電/腦電、骨密度等。

在醫(yī)學(xué)發(fā)展的過程中，這些方法發(fā)揮了巨大作用，隨著技術(shù)水平的發(fā)展，這些方法也在不斷提高和完善，也還會有其他新的診斷方法的問世。這些診斷有一個無法逾越的鴻溝：預(yù)測

也就是說“發(fā)病”了才能診斷。本文檔共61頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\4點22分基因診斷GeneDiagnosis：detectionofgeneticdisordersbyDNAanalysis

直接在DNA或RNA水平上進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能檢測，從而輔助臨床進(jìn)行的診斷?；蛟\斷是近年來臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)展十分迅速的一類嶄新的診斷技術(shù)，它依托DNA重組技術(shù)，直接從基因型入手，診斷表現(xiàn)型即可以越過產(chǎn)物（酶和蛋白質(zhì)）直接檢測基因結(jié)構(gòu)而作出診斷。（逆向診斷）基因診斷始于1978年，Kan第一次成功進(jìn)行了鐮狀細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前基因診斷?；蛟\斷具有靈敏度高、特異性強、費用低，并對許多疾病特別是遺傳性疾病具有預(yù)測性的特點，是一種極具潛力的診斷方法。本文檔共61頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\4點22分基因診斷的對象1、病原生物的侵入，如流感、肝炎、艾滋病2、單基因遺傳性疾病，如苯丙酮尿癥、無丙種球蛋白血癥3、多基因疾病，如腫瘤、高血壓4、其它，如親子鑒定、個體識別、法醫(yī)物證本文檔共61頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\4點22分神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病Wilson’sdisease(WD)Huntington’sdisease(HD)CadasilMelas(DMD)CMTSCALeigh本文檔共61頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\4點22分基因變異的類型1、點突變—１）單個堿基置換２）單個堿基的缺失或插入2、片段缺失—編碼片段；調(diào)節(jié)序列3、片段插入—編碼片段；調(diào)節(jié)序列4、重排—融合基因5、擴增—拷貝大量增加6、動態(tài)突變—遺傳物質(zhì)傳遞過程中不等交換使STR重復(fù)數(shù)增加本文檔共61頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\4點22分原理：找突變本文檔共61頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\4點22分基礎(chǔ)：PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）本文檔共61頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\4點22分DNA以指數(shù)形式擴增(2n)，其中長片段以線性形式擴增(2n+2)，最終主產(chǎn)物片段長度在兩個引物之間。預(yù)變性(92-95C,2-5m)變性(92-95C,30s)復(fù)性(40-60C,30s)延伸

(72C,30-60s)總延伸

(72C,7m)(25-35)PCR的一般過程：經(jīng)過30次的循環(huán),擴增的DNA片段可達(dá)100萬倍以上。24016256７11452228200短片段（單鏈）1412108642長片段（單鏈）128643216８４２總片段（單鏈）６５４３２１０循環(huán)數(shù)本文檔共61頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\4點22分策略1直接診斷：直接檢查致病基因本身的異常。它通常使用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴增產(chǎn)物，以探查基因無突變、缺失等異常及其性質(zhì)，這稱為直接基因診斷，它適用已知基因異常的疾病；間接診斷：當(dāng)致病基因雖然已知但其異常尚屬未知時，或致病基因本身尚屬未知時，也可以通過對受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色體。連鎖分析是基于緊密連鎖的基因或遺傳標(biāo)記通常一起傳給子代，因而考察相鄰DNA是否傳遞給了子代，可以間接地判斷致病基因是否傳遞給子代。連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態(tài)性位，特別是基因突變部位或緊鄰的多態(tài)性位點作為標(biāo)記。RFLP、VNTR、SSCP、AMP－FLP等技術(shù)均可用于連鎖分析。本文檔共61頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\4點22分遺傳標(biāo)記1、第一代遺傳標(biāo)記—限制性酶切片段長度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)8kb5kb3kb在個體和群體中，片段長度表現(xiàn)出多態(tài)性。如3kb,5kb,7kb,8kb…RFLP呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。常用檢查方法：核酸雜交；PCR-酶切等。本文檔共61頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\4點22分產(chǎn)生多態(tài)性的原因是內(nèi)切酶位點的變化。原位點的消失；新位點的產(chǎn)生。GAATTC

CTTAAGGATTTC

CTAAAG1212III2kb3kb5kb7kb本文檔共61頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\4點22分2、第二代遺傳標(biāo)記—微衛(wèi)星DNA(Micro-satelliteDNA)

屬高度重復(fù)序列，重復(fù)單元2~6bp，重復(fù)區(qū)大多幾十~幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了２萬余個位點。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG常用檢查方法：PCR等。本文檔共61頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\4點22分微衛(wèi)星DNAPCR擴增結(jié)果（示例）：500bp400bp300bp240bp

該結(jié)果顯示在所檢查的人群中，該位點多態(tài)性有4種。微衛(wèi)星DNA差異最小只相差2個堿基（重復(fù)片段只有2個堿基）。本文檔共61頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\4點22分2、第三代遺傳標(biāo)記—單核苷酸多態(tài)性(SNP)

某些DNA位點上，單個堿基存在著變化。如：AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT個體A個體B個體C

SNP分布于整個基因組，可在基因內(nèi)，也可在基因間。估計每1000個bp存在一個。在人類DNA序列變異中，SNP占90%。單個堿基的插入和缺失不認(rèn)為是SNP。目前已知基因組中含有150萬個SNP本文檔共61頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\4點22分芯片雜交結(jié)果示意圖ACGT位點1位點2位點3常用檢查方法：DNA測序、芯片雜交等。本文檔共61頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\4點22分常用技術(shù)本文檔共61頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\4點22分等位基因特異性寡核苷酸雜交（allele-specificoligonucleotide，ASO）

當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針（allele-specificoligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時需要合成兩種或兩種以上的探針，一種與正?；蛐蛄型耆恢?，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來.PCR可結(jié)合ASO，即PCR－ASO技術(shù)，即先將含有突變點的基因有關(guān)片段進(jìn)行體外擴增，然后再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節(jié)約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進(jìn)行。本文檔共61頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\4點22分異常探針

TAG正常人患者

DNADNA點雜交正常探針

GAG正常人患者

DNADNA點雜交本文檔共61頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\4點22分單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR(SSCP-PCR)DNA分子在電泳中的行為取決于分子量和分子構(gòu)象。DNA單鏈的構(gòu)象取決于序列。PCR產(chǎn)物變形后于中性膠中電泳，與正常對照比較，若電泳行為異常，則認(rèn)為內(nèi)含突變的堿基。本文檔共61頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\4點22分對照實驗本文檔共61頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\4點22分等位基因特異性PCR(Allele-SpecificPCR,AS-PCR)利用末端突變的引物進(jìn)行PCR。實際應(yīng)用中，常使用三個引物：A3’5’G3’5’5’3’正常上游引物正常下游引物突變上游引物使用正常引物，在正常人有擴增，異常人無擴增。使用突變引物，在異常人有擴增，正常人無擴增。（嚴(yán)格條件下的PCR）本文檔共61頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\4點22分ACGTATGGTACCGCAT本文檔共61頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\4點22分染色體FISH探針整條染色體涂染探針染色體重復(fù)序列探針染色體專一位點探針基本過程：1、染色體標(biāo)本制備2、探針制備3、雜交4、顯微觀察（染色體分帶）本文檔共61頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\4點22分整條染色體涂染本文檔共61頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\4點22分通過整條染色體涂染判斷易位染色體本文檔共61頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\4點22分引物原位標(biāo)記技術(shù)(PrimedinsituLabeling,PRINS)

針對染色體的特異性α-衛(wèi)星DNA序列設(shè)計和合成引物。

利用未標(biāo)記的寡核苷酸引物與變性后的染色體DNA特異結(jié)合,然后用熒光素標(biāo)記的脫氧核苷酸(dUTP)與未標(biāo)記的脫氧核苷酸一起在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸反應(yīng),標(biāo)記了的dUTP將以堿基配對的形式摻入到新合成的DNA單鏈中,最后用相應(yīng)的熒光抗體與標(biāo)記物結(jié)合以顯示檢測結(jié)果。

本文檔共61頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\4點22分舉例1DMD／BMD的缺失型診斷：DMD／BMD是一種Ⅹ連鎖隱性遺傳的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)受累的致死性遺傳病。DMD／BMD有70％左右為缺失型。此基因很大，缺失可發(fā)生在不同部位，因此應(yīng)盡可能采用多對引物作PCR擴增（多重PCR）來檢測。如擴增產(chǎn)物電泳后發(fā)現(xiàn)有帶紋的缺失，即可作出診斷并對缺失定位。在進(jìn)行產(chǎn)前診斷時，一般可先通過檢測家系中有關(guān)成員，即確定先證者的缺失區(qū)，然后有針對性地作PCR擴增，包括缺失部分的兩端，以判斷胎兒或有關(guān)患兒是否也獲得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。

本文檔共61頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\4點22分舉例2脊肌萎縮癥（SMA）5q13.1

SMN1,SMN2本文檔共61頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\4點22分舉例3Huntington’sDisease(HD)IT15（CAG）n本文檔共61頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\4點22分舉例4腓骨肌萎縮癥（CMT）Hereditarymotorandsensoryneuropathiesaclinicallyandgeneticallyheterogeneousgroupofinheritedneuropathiesdemyelination(CMT1)axonalloss(CMT2)autosomal-dominant,autosomal-recessive,andX-linkedinheritance.本文檔共61頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期二\4點22分myelinproteinzero(MPZ),earlygrowthresponsegene2(EGR2)peripheralmyelinprotein22(PMP22)myotubularinrelatedprotein2gene(MTMR2)theN-mycdownstreamregulatedgene1(NDRG1)theL-periaxingene(PRX)theganglioside-induceddifferentiation-associatedprotein1gene(GDAP1)connexin32gene(GJB1)本文檔共61頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期二\4點22分GJB1alteration(323T>C)本文檔共61頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期二\4點22分GJB1mutation323TC本文檔共61頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期二\4點22分舉例5CADASIL：subcorticalischemicstrokeandvasculardementiainhumanadults.Notch3isalargegenecomposedof33exonsencodingfora2321amino-acidsprotein.mutationsarehighlystereotypedmissensemutations,locatedwithinthe23exonsencodingforthe34EpidermalGrowthFactor(EGF)-likerepeatsoftheextracellulardomainoftheNotch3receptor,allmutationsresultingeitherinagainoralossofacysteineresidue.HighG-CContentupto88%(meanG-Ccontent~66%).In65%ofthepatients,thesemutationsareclusteredwithinexons3and4butinthe35%remainingones,mutationsarescatteredthroughthe21otherexons.本文檔共61頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期二\4點22分舉例6MERRF綜合癥—肌陣攣性癲癇和破碎紅纖維病多系統(tǒng)紊亂，肌陣攣性癲癇，共濟失調(diào)，輕度癡呆，耳聾，脊髓退化。大量團(tuán)塊狀線粒體聚集于肌細(xì)胞中（可被特異性染料染成紅色，—破碎紅纖維）。大腦卵圓核與齒狀核有神經(jīng)元的缺失。當(dāng)線粒體中90%存在這種突變，將出現(xiàn)典型癥狀，當(dāng)突變比例下降時，癥狀也隨之變輕。MTTK*MERRF8344G線粒體突變轉(zhuǎn)運RNA基因賴氨酸疾病縮寫突變位置該位原堿基本文檔共61頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期二\4點22分問題各種遺傳病的基因異常是不同的，同一遺傳病也可以有不同的基因異常。根據(jù)對基因異常類型的了解，可以采用不同的診斷方法如基因缺失可用基因探針雜交，PCR擴增直接檢測；點突變可用等位基因特異的ASO探針、SSCP等直接檢查。一般無需對家系成員進(jìn)行分析。但條件是必需知道基因異常的性質(zhì)，并肯定該異常與疾病之間的關(guān)系。然而，由于許多疾病的遺傳異質(zhì)性，以及多數(shù)遺傳的基因異常尚屬未知，目前能直接診斷的病種雖日益增多，但仍然是比較有限的。

本文檔共61頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期二\4點22分策略2熱點突變?nèi)驋呙璞疚臋n共61頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期二\4點22分肝豆?fàn)詈俗冃?/p>

1.AR2.臨床癥狀：

進(jìn)行性肝硬化，伴有基底神經(jīng)節(jié)豆?fàn)詈俗冃?，引起神?jīng)癥狀。

3.病因：存在細(xì)胞膜上的與銅轉(zhuǎn)運有關(guān)的ATP7B缺陷導(dǎo)致銅不能從細(xì)胞內(nèi)及時清除而在組織中沉積。

4、基因定位：13q14.3本文檔共61頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期二\4點22分ATP7Bgenemapstochromosome13q14.3,contains