中草藥鑒定種特異性DNA探針的篩選方法

中草藥鑒定種特異性DNA探針的篩選方法【摘要】基因芯片技術(shù)為中草藥高效、并行、快速鑒定提供了可能。而中草藥種特異性探針的篩選是中草藥基因芯片鑒定技術(shù)開發(fā)的關(guān)健。文章結(jié)合當(dāng)今中藥鑒別芯片和其它物種鑒定芯片研究進(jìn)展總結(jié)了幾種適合中草藥特異性探針篩選的方法。

【關(guān)鍵詞】基因芯片；中草藥鑒別；種特異；DNA探針

Abstract:DNAchiptechnologymakesitfeasibletoidentifyChineseherbalmedicinerapidly,efficientlyandinparallel.Thescreeningofspecies-specificDNAprobesfrommedicinalplantsisthekeystepindevelopingDNAchipfortheauthenticationofChineseherbalmedicines.CombinedwithcurrentDNAchipresearchesonidentificationofherbalplantsorotherspecies,somemethodsavailableforthescreeningofmedicinalplants‘species-specificDNAprobesweresummarizedinthispaper.

Keywords：DNAchip;Herbalmedicine;Species-specificDNAProbe

在中藥材基因鑒別和特征性基因測(cè)序的基礎(chǔ)上，建立以基因診斷和基因芯片為載體的中藥材分子鑒別技術(shù)和方法是今后中藥生物技術(shù)研究中的努力方向之一［1］。中藥鑒定的基因芯片技術(shù)是指采用原位合成或顯微打印手段，將中藥種特異性DNA探針固定在玻璃片、尼龍膜或其它支持物表面上，形成二維DNA探針陣列，然后與熒光或DIG標(biāo)記待檢中藥基因組DNA樣本雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥的準(zhǔn)確、并行、高效地檢測(cè)。雖然DNA芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于DNA測(cè)序［2］、單核苷酸多態(tài)性分析［3］、基因表達(dá)分析［4］、基因診斷［5］、藥物篩選［6］、微生物種類鑒定等［7］各個(gè)方面，但應(yīng)用于中藥鑒定尚處于起步階段，近年來隨著基因芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外一些研究機(jī)構(gòu)已開始研究使用基因芯片對(duì)中藥(材)進(jìn)行鑒別［8，9］。采用基因芯片技術(shù)鑒定中藥的基本過程是［10］：①應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)找出待鑒定中藥的特定寡核苷酸序列；②以此寡核苷酸序列作為探針，裝配到芯片上；③檢測(cè)樣品的提取、擴(kuò)增和標(biāo)記；④雜交檢測(cè)及結(jié)果分析。其中找出待定中藥的特定DNA序列是建立中草藥鑒定基因芯片的關(guān)鍵。本文結(jié)合近年來中藥及其它物種鑒別芯片研究進(jìn)展總結(jié)了幾種可用于中草藥特異性DNA片段篩選的方法，并對(duì)這些方法的優(yōu)勢(shì)和不足做出評(píng)價(jià)。

1利用現(xiàn)有藥用植物基因資源篩選其特異性片段

首先，登錄GeneBank網(wǎng)站，在核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索研究對(duì)象及其相關(guān)種屬的基因序列(如植物的rRNA的ITS序列或微衛(wèi)星序列或某種功能基因)，應(yīng)用分析軟件，對(duì)這些序列進(jìn)行對(duì)齊和分析，得到堿基對(duì)齊圖和聚類分析的結(jié)果。然后根據(jù)對(duì)齊圖找出具有高度多態(tài)性的區(qū)段，在這一區(qū)段用Primers程序設(shè)計(jì)引物并在相應(yīng)區(qū)段結(jié)合Oligo程序找出所有可能的探針，經(jīng)過篩選后在Genebank中進(jìn)行Blast查詢，篩選出特異性最好的片段作為探針使用。

這種方法簡(jiǎn)單、快捷，充分利用了現(xiàn)有的基因資源。目前很多微生物檢測(cè)探針［11,12］及植物cDNA探針［13］都是根據(jù)已公開的基因序列設(shè)計(jì)的。然而，對(duì)于大多數(shù)藥用植物種類，其遺傳背景很不清楚。已注冊(cè)的藥用植物DNA序列的數(shù)量相對(duì)于總的藥用植物資源非常有限，而且這些已知序列中大多集中在少數(shù)植物種類［14］，所以，這種方法只適合于遺傳背景比較清楚或已有相關(guān)序列發(fā)布的藥用植物。

2通過構(gòu)建的DNA文庫(kù)篩選

這種方法要求先構(gòu)建DNA克隆文庫(kù)或cDNA文庫(kù)，然后從文庫(kù)中隨機(jī)選出若干克隆，將各克隆插入片段斑點(diǎn)印跡在雜交膜上(如硝酸纖維膜、尼龍膜)，用標(biāo)記的本種基因組和其他種基因組的總DNA為探針分別進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，選擇與本種基因組雜交時(shí)雜交信號(hào)強(qiáng)，而與其他基因組雜交時(shí)無雜交信號(hào)的克隆，該克隆的插入序列即為本種基因組的特異序列。

Q.Cai.Bullen［15］從梯牧草屬(Phleum)兩個(gè)野生種P.alpinum和P.bertolonii的DNA文庫(kù)中分別篩選到它們的特異性探針。首先，提取P.alpinum和P.bertolonii的總DNA，用Sau3AI部分酶切，然后將消化后片段用pUC19作為載體克隆到E.coliDH5amcr.構(gòu)建了P.alpinum和P.bertolonii的部分基因組DNA文庫(kù)，接著從P.alpinumDNA文庫(kù)中選了1230個(gè)克隆，從P.bertoloniiDNA文庫(kù)中選了1320個(gè)克隆斑點(diǎn)印跡在膜上，最后和通過缺口平移法采用［α～32P］-dCTP標(biāo)記的P.alpinum和P.bertolonii總基因組探針雜交，根據(jù)雜交信號(hào)挑選到P.alpinum特異性克隆8個(gè)，P.bertolonii特異性克隆13個(gè)，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序后篩選到3個(gè)P.alpinum特異性探針和3個(gè)P.bertolonii特異性探針。還有其它通過類似方法篩選到植物種特異性探針的例子［16,17］。

這種方法可以一次篩選大量克隆，能得到相當(dāng)數(shù)量的探針，主要問題是構(gòu)建DNA庫(kù)過程比較繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，文庫(kù)質(zhì)量也會(huì)影響篩選效果。再是如果從cDNA文庫(kù)中篩選，因cDNA是切除了內(nèi)含子的DNA序列，而很多內(nèi)含子本身在種間具有高度多態(tài)性，這些序列的切除會(huì)降低種特異性探針的篩選效率。

3從nrDNA篩選

因結(jié)構(gòu)和功能上的差異，植物基因組不同部位的序列變異速度很不一致，一般情況編碼區(qū)比較保守，而非編碼區(qū)序列因其功能上的限制較少,比編碼區(qū)表現(xiàn)出更快的進(jìn)化速率，不同種間各編碼序列或非編碼序列的變異方式和速率也是千差萬別。植物細(xì)胞核中編碼rRNA的基因分編碼區(qū)和非編碼區(qū)，其中編碼區(qū)的18S與，與26S基因間被兩個(gè)非編碼區(qū)ITS1和ITS2所間隔。它們共同組成一轉(zhuǎn)錄單位——順反子(cistron)，順反子高度重復(fù)(幾百至幾千次),以串聯(lián)的方式排列于核染色體上,并且這些核糖體RNA順反子拷貝表現(xiàn)出高度的均一性(homogeneity)［18］。據(jù)此特征，可根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出易變異區(qū)DNA片段，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析后，從中篩選出可做為種特異性探針的寡核苷酸序列［19］。

ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))

高等植物中nrDNA序列差異主要表現(xiàn)在ITS、ETS及IGS等非編碼區(qū)上。被子植物中ITS序列既具有核苷酸序列的高度變異性又有長(zhǎng)度上的保守性。有研究表明［18］：被子植物大多數(shù)科屬其ITS序列的種間差異值為%～%，屬間差異值為%～%，這對(duì)系統(tǒng)發(fā)育研究來說都是較合適的范圍，也適合從這些序列中篩選種特異性探針。ZhangYB等［20］將16個(gè)不同種屬石斛的序列固定于玻片上制作了基因芯片，并用熒光標(biāo)記的ITS2序列作為探針,可檢測(cè)出5種已被載入《中國(guó)藥典》的石斛。該基因芯片還可檢測(cè)出含有9種不同的中藥材復(fù)方中的石斛。劉建全等［21］從市售“藏茵陳”藥材中提取DNA,PCR擴(kuò)增rDNA-ITS2整個(gè)片段，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序得到約700bp片段，采用排序和系統(tǒng)發(fā)育分析軟件分析“藏茵陳”原植物的親緣關(guān)系，據(jù)此設(shè)計(jì)的特異性分子快速鑒定試劑盒可對(duì)市場(chǎng)上的藏茵陳進(jìn)行檢測(cè)。

26SrDNAnrDNA編碼區(qū)比較保守，但其中有些可變區(qū)，不同的植物類群，其可變區(qū)變異率有很大差別。對(duì)于變異率大的類群，可以據(jù)此從中篩選到鑒別DNA探針。

為了對(duì)不同種的貝母進(jìn)行區(qū)分，香港城市大學(xué)及香港理工大學(xué)的研究者［22］設(shè)計(jì)了一種基因芯片可有效地對(duì)不同種的貝母進(jìn)行區(qū)分。他們首先提取9種貝母球莖的基因組DNA，用引物對(duì)(上游引物5′-GAGTCGGGTTGTTTGGGA-3′；下游引物5′-GCTATCCTGAGGGAAACTTC-3′)對(duì)其26SrDNA基因D2與D3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，從其多態(tài)性區(qū)段設(shè)計(jì)了各種屬特異性寡核苷酸探針，然后將不同種屬寡核苷探針點(diǎn)置于經(jīng)多聚賴氨酸處理包被的芯片。用來自不同種貝母的熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與DNA芯片進(jìn)行雜交，可在芯片特定位置檢測(cè)到不同種貝母的熒光信號(hào)從而達(dá)到區(qū)分不同貝母的目的。

陳月琴等［23］從采自陜西秦嶺和廣東自然保護(hù)區(qū)的杜仲中提取總DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒載體PTZ19連接，Sanger終止法測(cè)定26SrDNA片段，采用計(jì)算機(jī)分析軟件Pcgene610比較了金縷梅、栓皮櫟、水青樹、領(lǐng)春木及前人測(cè)定的8種植物的同源序列，找出其特征性核苷酸序列，為進(jìn)一步開展杜仲的專一性核酸分子探針研究奠定基礎(chǔ)。

rDNACarlesMaria等［24］設(shè)計(jì)和制作了一種能鑒別有毒中草藥的DNA芯片。芯片中種特異性寡核苷酸探針來源于Aconitumcarmichaeli，A.kusnezoffi，Alocasiamacrorrhiza，Crotontiglium，等17種中藥的rRNA基因及Aconitumpendulum和Stellerachamaejasme的Leu-tRNA基因，這些探針通過巰基連接固定在硅片上，靶基因序列通過不對(duì)稱PCR擴(kuò)增和熒光標(biāo)記后與芯片雜交，通過這種并行的基因分型技術(shù)可以將多種有毒草藥種類鑒別出來。

18SrDNAG.fragilis是一種產(chǎn)生大量粘液狀物質(zhì)的微藻，在亞德里亞海的大量繁殖時(shí)嚴(yán)重影響水產(chǎn)和旅游業(yè)。為了對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)，F(xiàn).Tinti·L等［25］從G.fragilis的18SrDNA中篩選出了可用作檢測(cè)海水中G.fragilis的寡核苷酸探針。主要過程是：從培養(yǎng)的G.fragilis細(xì)胞提取其總DNA，用引物對(duì)16S1N-16S2N擴(kuò)增其18SrDNA基因，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GeneBank中Lingulodiniumpolyedrum,Gonyaulaxspinifera,Protoceratiumreticulatum的同源序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)后發(fā)現(xiàn)G.fragilis的18SrDNA核苷酸序列與其它種有明顯的不同，因此可用此序列用于G.fragilis鑒定的特異性探針或制成芯片用于海水中這種有害藻種的常規(guī)監(jiān)測(cè)。

從上述例子可以看到有些探針的是從rRNA編碼區(qū)基因篩選出來，因這些區(qū)段的保守性，在不同品種間的變化比較有限，難于篩選到有較大差異的長(zhǎng)探針，對(duì)有些類群的植物甚至難于奏效，如需鑒別的種類較近緣時(shí)，從非編碼區(qū)篩選可能會(huì)得到更好的結(jié)果。

4從葉綠體DNAmatK，trnL基因篩選

目前常用于生藥分析的葉綠體基因組中的基因片段有核酮糖-1,5-二磷酸酯羧化酶基因(rbcL)，編碼成熟酶基因(matK)，編碼RNA聚合酶B亞基基因(rpoC)，編碼tRNA-lysine基因(trnL)，編碼核糖體大亞基蛋白16基因(rpl16)，編碼核糖體小亞基蛋白4基因(rps4)等［26］。其中matK基因在葉綠體基因組中的所有編碼蛋白基因中進(jìn)化速率最快，常被用來研究被子植物科內(nèi)水平的近緣關(guān)系研究中。再就是trnL基因，trnL基因內(nèi)有三段非編碼區(qū)，由于不受功能的限制，其進(jìn)化速率大于功能編碼區(qū)，目前被廣泛用于植物系統(tǒng)學(xué)研究，也可以作為種特異性探針篩選的目標(biāo)區(qū)段。

目前還未見從葉綠體基因中篩選中藥鑒別探針的報(bào)道，但應(yīng)用其相關(guān)序列進(jìn)行鑒別的事例很多，如章群［27］運(yùn)用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法測(cè)定杜仲原植物matK基因序列，通過Clustal軟件將其與GenBank中同源序列進(jìn)行排序比較，發(fā)現(xiàn)32個(gè)特異性位點(diǎn)和一個(gè)杜仲所獨(dú)有的GAC插入序列，結(jié)論認(rèn)為matK基序列的測(cè)序分析可成為杜仲正品鑒定的有效手段。

5從差減DNA克隆庫(kù)中篩選

抑制差減雜交法是Diatchenko等［28］所創(chuàng)立，最初是應(yīng)用于建立差異cDNA文庫(kù)，它是一種在差減cDNA和RDA的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基于PCR的差異基因表達(dá)篩選方法。其基本原理是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火，比鏈間退火更穩(wěn)定，從而使非目的序列片段兩端反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類似于“鍋柄”的結(jié)構(gòu)，無法與引物配對(duì)，從而選擇性地抑制了非目的片段的擴(kuò)增，而差異片段得到富集。

李同祥［29］利用該方法進(jìn)行石斛鑒別DNA探針的篩選。首先獲得兩種石斛之間差減片段，然后選部分差異片段克隆分別和所有實(shí)驗(yàn)石斛的總DNA雜交，從中篩選出能與同種石斛DNA雜交而與其它種DNA不能雜交的克隆作為該種石斛專屬DNA探針，將這些探針點(diǎn)在尼龍膜上制成微陣列，可靈敏而快速地鑒別出迭鞘石斛(D.aurantiacumKerr)，金釵石斛(D.nobileLind.)，鐵皮石斛(D.ofcinaleKimuraetMigo)，鼓糙石斛(Lindl.)，流蘇石斛(Hook)。因抑制差減雜交法的篩選目標(biāo)基因是整個(gè)基因組，所以可以得到大量的探針，而且可以得到長(zhǎng)堿基序列的探針，選擇更近緣的種做為Driver有利于提高差減克隆中種特異性探針的比例，從而提高篩選效率，不足之處是過程比較復(fù)雜，各步驟反應(yīng)條件難于把握。

6利用RAPD、AFLP分子標(biāo)記構(gòu)建探針

RAPD、AFLP分子標(biāo)記不但可以直接用來進(jìn)行中藥材的鑒別和藥材道地性鑒定，還可以通過回收RAPD，AFLP多態(tài)性產(chǎn)物，克隆后作為RFLP探針［32］或作為篩選人工染色體文庫(kù)(BAC、YAC文庫(kù))的特異性探針［33］，或?qū)Χ鄳B(tài)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，設(shè)計(jì)特異性引物探針［34］，用于中草藥的鑒別。

此方法涉及4個(gè)步驟:①DNA抽提；②RAPD或AFLP擴(kuò)增；③特異性條帶的回收測(cè)序；④探針的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證。莊南生等［35］應(yīng)用AFLP標(biāo)記技術(shù)獲得了甘蔗祖親種的AFLP特異片段478條，對(duì)其中部分AFLP特異片段通過斑點(diǎn)雜交和Southern雜交分析，篩選出了5個(gè)甘蔗屬特異性探針，2個(gè)斑茅特異性探針。通過RAPD或AFLP的方法不設(shè)計(jì)引物，方法上比較簡(jiǎn)單省事，但獲得的探針數(shù)量有限，很多情況難以得到探針。

綜上所述，中藥鑒別種特異性探針可以從多種途徑獲得，可以根據(jù)特定的設(shè)計(jì)選擇有效的篩選途徑。需要指出的是某DNA同源區(qū)段具多態(tài)性并不代表能從其中篩選出特異性探針，這是因?yàn)樘禺愋蕴结樤陂L(zhǎng)度、堿基組成及其與其它種相應(yīng)區(qū)段的變異程度都有一定的要求；另外，為提高芯片鑒別的準(zhǔn)確性，有必要制備同一物種的多枚探針以增強(qiáng)其特異性，即使這樣，這種特異性是相對(duì)的，只是增加探針的數(shù)量會(huì)最大限度地減少其它植物種類中同時(shí)出現(xiàn)相同序列的概率。隨著中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程及分子生物學(xué)技術(shù)在中藥研究中更廣泛的應(yīng)用，會(huì)有越來越多的中藥基因特征性序列被揭示，只有足夠數(shù)量中草藥種類相應(yīng)的特異性探針被設(shè)計(jì)出來，利用基因芯片技術(shù)對(duì)中藥的并行、快速、高效的檢測(cè)才能真正實(shí)現(xiàn)。

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