污染物的生物效應檢測

第一節(jié)生物測試及方式一、生物測試的定義

生物測試指系統(tǒng)地利用生物的反應測定一種或多種污染物或環(huán)境因素單獨或聯(lián)合存在時，所導致的影響或危害。

可利用包括分子、細胞、組織、器官、個體、種群、群落—生態(tài)系統(tǒng)各級水平上的反應。可作為化學和物理的檢測的補充。能全面地評定污染物對生態(tài)系統(tǒng)的影響。本文檔共127頁；當前第1頁；編輯于星期二\2點41分生物測試的意義監(jiān)測環(huán)境質(zhì)量的變化確定單一污染物的安全濃度研究多種污染物的聯(lián)合作用的生物效應制定污染物的排放標準和環(huán)境質(zhì)量標準污染物的生態(tài)風險評價水污染的生物測試——毒性試驗對大氣污染的生物測——植物人工熏氣本文檔共127頁；當前第2頁；編輯于星期二\2點41分(一)生物測試的分類

1.短期生物測試將被測試的生物在短時間內(nèi)暴露于高濃度的污染物下，測定污染物對生物機體的影響。包括的指標：半數(shù)致死濃度(LC50)半數(shù)抑制濃度(IC50)半數(shù)效應濃度(EC50)作用：可為中期或長期試驗時所應使用的毒物濃度提供必要的依據(jù)。形式：靜止式，流動式本文檔共127頁；當前第3頁；編輯于星期二\2點41分靜止式：大多數(shù)情況下采用流動式：在以下特殊情況下采用易揮發(fā)或不穩(wěn)定污染物因為在試驗過程中污染物濃度會降低，受試生物對污染物的暴露程度會逐漸減少。代謝速率快的受試生物因為排出代謝廢物較多，代謝廢物的累積和分解會產(chǎn)生不適當?shù)母邼舛榷趸己桶?，從而影響試驗結(jié)果。

BOD較高的廢水因為溶解氧的耗盡會對受試生物造成壓迫。本文檔共127頁；當前第4頁；編輯于星期二\2點41分2.中期生物測試中期生物測試是介于短期和長期之間的一類生物測試方法。在短期與中期或在中期與長期之間，沒有嚴格的區(qū)分。一般的劃分：8d之內(nèi)算做短期

8~90d的算做中期中期的試驗可以是靜止式，但在大多數(shù)情況下采用流動式。本文檔共127頁；當前第5頁；編輯于星期二\2點41分3.長期生物測試指在低濃度污染物作用下，暴露時間要盡可能長達受試生物的整個生活史的一類生物測試，又稱全生活史生物測試。動物：要從一個卵期到下一代的卵期或更長時間內(nèi)連續(xù)進行。如浮游生物：可持續(xù)好幾代。部分生活史的生物測試：有些生物的生活史很長，甚至長達數(shù)年，因此，人們選用在整個生活史中的最敏感幾個階段來進行。本文檔共127頁；當前第6頁；編輯于星期二\2點41分(二)受試生物的選擇受試生物必須符合的條件：對試驗毒物或因子要具有敏感性。應具有廣泛的地理分布和足夠的數(shù)量，并在全年中在某區(qū)域范圍內(nèi)可獲得。應是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，具有重大的生態(tài)學價值。在實驗室內(nèi)易于培養(yǎng)和繁殖。本文檔共127頁；當前第7頁；編輯于星期二\2點41分應具有豐富的生物學背景資料，較清楚生活史、生長、發(fā)育、生理代謝等等。對試驗毒物或因子的反應能夠被測定，并具有一套標準的測定方法或技術。應具有重要的經(jīng)濟價值和旅游價值，應考慮與人類食物鏈的聯(lián)系。本文檔共127頁；當前第8頁；編輯于星期二\2點41分三、生物測試的標準化（一）影響生物測試結(jié)果的因素1.試驗條件

試驗的溫度、水質(zhì)和鹽分、水流速度、溶解氧、受試生物的總量、試驗溶液的pH值和構成試驗裝置材料等不僅影響生物對毒物的反應，而且影響作用于生物的毒物濃度、性質(zhì)和形態(tài)。本文檔共127頁；當前第9頁；編輯于星期二\2點41分2.受試生物的敏感性生物對毒物的敏感性受生物的年齡、生活階段、尺寸大小、季節(jié)、脫皮階段、食物等因素影響。3.不同的實驗室不同實驗室的人員的操作水平、儀器設備和采用的統(tǒng)計分析方法等也使測試結(jié)果在不同實驗空間有很大的差異。本文檔共127頁；當前第10頁；編輯于星期二\2點41分（二）測試方法標準化的優(yōu)點在同一類型的不同實驗室中進行許多有用的測試并把結(jié)果選擇出來。增加數(shù)據(jù)的精確度測試可以被其他實驗室重復各種人員容易進行該試驗可方便地將數(shù)據(jù)進行比較可為環(huán)境管理、環(huán)境立法(環(huán)境標準建立)提供可靠的數(shù)據(jù)或結(jié)果。本文檔共127頁；當前第11頁；編輯于星期二\2點41分第二節(jié)一般毒性試驗—、生物毒性的基本概念（一）毒物與中毒1.毒物在一定條件下，以較小劑量給予機體時，能與生物相互作用，引起生物體功能或器質(zhì)性損傷的化學物質(zhì)，或劑量雖微，但累積到一定的量，就能干擾或破壞機體的正常生理功能，引起暫時或持久性的病理變化，甚至危及生命的化合物，亦稱毒物。本文檔共127頁；當前第12頁；編輯于星期二\2點41分毒物與非毒物之間并不存在絕對的界限，而只能以引起中毒的劑量大小相對地加以區(qū)別。討論一種化學物質(zhì)的毒性時，必須考慮到它進入機體的數(shù)量(劑量)、方式(經(jīng)口食人、經(jīng)呼吸道吸入、經(jīng)皮膚或粘膜接觸)和時間分布(一次或反復多次給予)。最基本的因素是劑量。本文檔共127頁；當前第13頁；編輯于星期二\2點41分2.中毒生物體受到毒物作用引起功能或器質(zhì)性改變后出現(xiàn)的疾病狀態(tài)稱中毒。中毒是各種毒性作用的綜合表現(xiàn)(包括局部的和全身的)。根據(jù)病變發(fā)生發(fā)展的快慢，可區(qū)分為：

急性中毒亞急性中毒慢性中毒本文檔共127頁；當前第14頁；編輯于星期二\2點41分3.毒性有毒物質(zhì)接觸或進入機體后，引起生物體的易感部位產(chǎn)生有害作用的能力。(1)毒性作用或毒效應化學物引起生物體損害的總稱為毒性作用。毒性作用可通過觀測的方法來判斷。例如：有機磷農(nóng)藥對膽堿酯酶有抑制作用；苯可抑制造血功能導致貧血；強酸、強堿可引起局部的皮膚灼傷等等本文檔共127頁；當前第15頁；編輯于星期二\2點41分(2)無損害作用無損害作用的特點：

不引起機體形態(tài)、生長發(fā)育和壽命的改變；不引起機體功能容量的降低和對額外應激狀態(tài)代償能力的損害；

所引起的生物學變化一般是可逆的，當停止接觸化學物后，不能檢出機體維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)能力的降低；

不能使機體對其他環(huán)境因素不利影響的易感性增強。本文檔共127頁；當前第16頁；編輯于星期二\2點41分(3)損害作用生物體接觸外來化學物期間或停止接觸后可導致的損害作用包括：機體維持體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)能力產(chǎn)生不可逆的下降；對某些環(huán)境因素不利影響的易感性增高；代謝速度降低；酶系的相對活力發(fā)生異常改變。本文檔共127頁；當前第17頁；編輯于星期二\2點41分(4)效應與反應效應(Effect)表示接觸一定劑量化學物質(zhì)引起機體個體發(fā)生的生物學變化。例如：接觸某些有機磷農(nóng)藥可引起膽堿酯酶活力降低，即為有機磷農(nóng)藥引起的效應。反應(Response)接觸一定劑量化學物質(zhì)后，表現(xiàn)一定程度某種效應的個體在一個群體中所占的比例。例如：由于接觸某種化學物質(zhì)引起死亡的動物占該群動物的50％。本文檔共127頁；當前第18頁；編輯于星期二\2點41分(5)劑量—效應關系和劑量—反應關系劑量—效應關系：表示不同劑量在個體或群體中表現(xiàn)出來的量效應大小之間的關系，劑量—反應關系：表示不同劑量與其效應發(fā)生率之間的關系。劑量反應關系是評價化學物質(zhì)的毒性和確定安全接觸水平的基本依據(jù)。測定這種關系是毒性試驗和化學物質(zhì)安全評價的基本內(nèi)容之一。本文檔共127頁；當前第19頁；編輯于星期二\2點41分(6)危害性有毒物質(zhì)在與機體接觸或使用過程中引起中毒的可能性。在評價毒物的毒性及危害性時，單憑絕對毒性是不夠的，應考慮到這種物質(zhì)的揮發(fā)性和在水或血液中的溶解性。揮發(fā)性小、易溶于水或血液中并能迅速達到中毒濃度的化學物質(zhì)其危害性就大，反之則小。本文檔共127頁；當前第20頁；編輯于星期二\2點41分危害性與毒性不同任何一種毒物不論其毒性強弱，其危害性大小取決于動物是否與它接觸過以及該物質(zhì)進入機體的能力和數(shù)量。(7)危險性某化學物質(zhì)在正常生產(chǎn)使用條件下，能引起機體發(fā)生中毒的可能性稱為危險性。例如：脂性物質(zhì)易蓄積在脂肪中，不僅影響機體的脂肪代謝，而且具有慢性中毒的危險性。本文檔共127頁；當前第21頁；編輯于星期二\2點41分(二)表示毒性的常用參數(shù)1.毒性試驗常用參數(shù)

(1)致死劑量或致死濃度LethalDose，LDLethalConcentration，LC表示一次染毒后引起受試動物死亡的劑量或濃度。絕對致死劑量或濃度(LDl00；LC100)：表示一群動物全部死亡的最低劑量或濃度。本文檔共127頁；當前第22頁；編輯于星期二\2點41分半數(shù)致死劑量或濃度(LD50；LC50)：能引起一群動物的50％死亡的最低劑量或濃度。最小致死劑量或濃度(MLD，MLC)：能使一群動物中僅有個別死亡的最高劑量或濃度。最大耐受劑量或濃度(LD0，LC0)：能使一群動物雖然發(fā)生嚴重中毒，但全部存活無一死亡的最高劑量或濃度。本文檔共127頁；當前第23頁；編輯于星期二\2點41分(2)最大無作用劑量指化學物在一定時間內(nèi)，按一定方式與機體接觸，按一定的檢測方法或觀察指標，不能觀察到任何損害作用的最高劑量。外來化合物對機體的損害作用或毒作用表現(xiàn)為引起機體發(fā)生某種生物學變化，此種生物學變化隨劑量的遞減而減弱。當外來化學物的劑量減到一定量但尚未到零時，生物學變化已達到零，即不能再觀察到外來化學物所引起的生物學變化，此劑量即為最大無作用劑量。本文檔共127頁；當前第24頁；編輯于星期二\2點41分最大無作用劑量：是評定外來化合物毒性作用的主要依據(jù)，并可以其為基礎，制訂人體每日容許攝入量和最高容許濃度。每日容許攝入量(ADI)：指人類終生每日攝入該外來化學物對人體不致引起任何損害作用的劑量。最高容許濃度：指某一環(huán)境污染物可以在環(huán)境中存在而不致對人體造成任何損害作用的濃度。本文檔共127頁；當前第25頁；編輯于星期二\2點41分(3)最小有作用劑量

指能使機體發(fā)生某種異常變化所需的最小劑量，即能使機體開始出現(xiàn)毒性反應的最低劑量。因為最小有作用劑量一般都是略高于最大無作用劑量，故亦稱為中毒閾劑量(ThresholdLevel)。具有類似意義的是最小有作用濃度，表示環(huán)境中存在某些環(huán)境污染物能引起機體開始出現(xiàn)毒性反應所必需的最低濃度。本文檔共127頁；當前第26頁；編輯于星期二\2點41分(4)毒作用帶一種根據(jù)毒性和毒性作用特點綜合評價外來化合物危險性的指標。常用的有：急性毒性作用帶比值愈大，外來化合物引起死亡的危險性就愈小；比值愈小，引起死亡的危險性就愈大。本文檔共127頁；當前第27頁；編輯于星期二\2點41分

慢性毒性作用帶比值愈大，引起慢性毒性中毒的可能性愈大；比值愈小，引起慢性中毒的可能性愈小，而引起急性中毒危險性則相對較大。本文檔共127頁；當前第28頁；編輯于星期二\2點41分(5)半數(shù)效應濃度MedianEffectConcentration，EC50指能引起50％受試生物的某種效應變化的濃度。通常指非死亡效應。(6)半數(shù)抑制濃度MedianInhibitionConcentration，IC50是指能引起受試生物的某種效應50％抑制的濃度。本文檔共127頁；當前第29頁；編輯于星期二\2點41分2.毒物單位與分級(1)毒物單位吸入毒物:以在空氣中的濃度以mg／m3、mg／L表示;哺乳動物:以mg／kg,或ml／kg體重表示;水環(huán)境中毒物:以mg／L、ug/L表示每單位體表面給藥量(mg／m2)表示本文檔共127頁；當前第30頁；編輯于星期二\2點41分(2)毒性分級目前使用的分級方法、標準和毒性級的名稱在毒理學文獻中很不統(tǒng)一，因而往往造成混亂和判斷的錯誤;目前要統(tǒng)一也比較困難;國內(nèi)較為通用的毒性分級系統(tǒng)列于表3-1～3-6。本文檔共127頁；當前第31頁；編輯于星期二\2點41分本文檔共127頁；當前第32頁；編輯于星期二\2點41分本文檔共127頁；當前第33頁；編輯于星期二\2點41分本文檔共127頁；當前第34頁；編輯于星期二\2點41分二、急性毒性試驗AcuteToxicityTest研究化學物質(zhì)大劑量一次染毒或24h內(nèi)多次染毒動物所引起的毒性試驗。目的：

在短期內(nèi)了解該物質(zhì)的毒性大小和特點，并為進一步開展其他毒性試驗提供設計依據(jù)。本文檔共127頁；當前第35頁；編輯于星期二\2點41分（一）哺乳動物急性毒性試驗實驗動物：小鼠、大鼠、豚鼠、兔染毒方式：毒物飼喂、經(jīng)皮接觸常規(guī)方法：（1）先查閱文獻中與受試物類似的動物的LD50；（2）以3倍之差的3個劑量組進行預試驗，每組3只動物，求出動物全活、全死劑量；本文檔共127頁；當前第36頁；編輯于星期二\2點41分（3）在全活全死劑量之間設5～6個劑量組，各組間距按1.2-1.5等比級數(shù)設計；（4）選用適宜的染毒方式染毒，觀察2周內(nèi)的死亡情況；（5）剖檢死亡和瀕死動物及部分存活動物，做大體病理解剖檢查；（6）計算LD50或LC50。本文檔共127頁；當前第37頁；編輯于星期二\2點41分(二)水生生物急性毒性試驗1.魚類毒性試驗(1)實驗用魚的選擇必須具有一定區(qū)域代表性；便于在實驗條件下飼養(yǎng)；對化學物質(zhì)較為敏感；一般體長在7cm以下為宜。采用金魚時，一般在3cm以下，最長體長不應超過最小體長的1.5倍。選擇行動活潑、體色光澤、魚鰭完整舒展、逆水性強和食欲好的健康魚，在實驗室內(nèi)觀察一周后使用。本文檔共127頁；當前第38頁；編輯于星期二\2點41分(2)實驗條件實驗容器采用玻璃缸或白搪瓷桶，其盛水量以每條魚2～3L水為宜，水的pH值為6.7~8.5，冷水溫度為12~18℃，溫水溫度為20～28℃，水溫變化為±2℃。水中溶解氧不能低于4mg／L，可用清潔的河水、湖水或放置3天以上的自來水。本文檔共127頁；當前第39頁；編輯于星期二\2點41分（3）半數(shù)致死濃度(LC50)的測定預試驗：確定100％致死濃度和不引起死亡的最大濃度。在此濃度范圍，按等對數(shù)間距確定5~7個濃度組（包括對照），10~20尾/組，染毒48~96h。染毒剛開始8h內(nèi)經(jīng)常觀察，以后可作24h、48h、72h、96h的定期觀察，記錄中毒反應及死亡時間。死亡魚立即取出剖檢。本文檔共127頁；當前第40頁；編輯于星期二\2點41分試驗期間：保持溶解氧、pH值、水溫等的穩(wěn)定；記錄24h、48h、96h各組魚的死亡數(shù)；按LC50計算方法，求出相應時間的LC50。采用的計算方法：

直線內(nèi)插法對數(shù)—概率模式法本文檔共127頁；當前第41頁；編輯于星期二\2點41分2.水蚤類急性毒性試驗水蚤類是淡水生物，對許多毒物很敏感。水蚤類的世代周期短，實驗室易培養(yǎng)，產(chǎn)仔量多，是一類很好的試驗生物，且試驗項目使用的參數(shù)在個體間相對恒定，為試驗結(jié)果統(tǒng)計學處理提供方便。試驗裝置簡單，省人力，在水毒理學研究上廣泛應用。大型水蚤是水蚤類毒性試驗的標準生物，試驗用水蚤一般為孤雌生殖新生蚤(<24h)。本文檔共127頁；當前第42頁；編輯于星期二\2點41分3.藻類急性毒性試驗通過測定藻類的生物量，可評價有害物質(zhì)對藻類生長的作用，反映對水體中初級生產(chǎn)營養(yǎng)級的影響以及對整個水生生態(tài)系統(tǒng)的可能的綜合環(huán)境效應。在藻類毒性試驗中，應定時取樣測定藻類的生長情況，一般為24h或48h取樣一次。在72h和96h取樣測定毒物對藻類影響的IC50值，即與對照相比，生長率抑制50％的毒性濃度。本文檔共127頁；當前第43頁；編輯于星期二\2點41分(三)蚯蚓急性毒性試驗蚯蚓急性毒性試驗的目標：評價環(huán)境中化學物質(zhì)，如農(nóng)藥對土壤中動物的急性傷害。常用的蚯蚓品種：赤子愛勝蚓，其生活周期短，繁殖能力強，易于飼養(yǎng)。赤子愛勝蚓不是典型的土壤種類，但它存在于富含有機質(zhì)的土壤中，對化學物質(zhì)的敏感性與棲息在一般土壤中的蚯蚓類似。本文檔共127頁；當前第44頁；編輯于星期二\2點41分方法：濾紙接觸毒性試驗：濾紙接觸毒性試驗簡單易行，可對受試物毒性進行初篩。將蚯蚓與濕潤濾紙上的受試物接觸，測定土壤中受試物對蚯蚓的潛在影響。

人工土壤試驗：將蚯蚓置于含不同濃度受試物的人工配制土壤中，飼養(yǎng)7d和14d，評價其死亡率。應包括使生物無死亡發(fā)生和全部死亡的兩組濃度。整個試驗期為14d，每一處理組和對照組應有4個平行樣。本文檔共127頁；當前第45頁；編輯于星期二\2點41分三、亞慢性和慢性毒性試驗

（一）亞慢性毒性試驗在相當于動物生命周期的1／30~1／20時間內(nèi)，使動物每日或反復多次接觸受試物的毒性試驗。其目的是為進一步對受試物的主要毒作用、靶器官和最大無作用劑量或中毒閾劑量作出估計。本文檔共127頁；當前第46頁；編輯于星期二\2點41分1.實驗動物及分組（1）亞慢性試驗中試驗動物的種屬和品系，應當是急性毒性試驗證明的對受試物敏感的動物種屬和品系，同時還應考慮與慢性毒作用試驗中預計使用的動物種屬和品系相同。（2）一般要求選擇兩種試驗動物，嚙齒類和非嚙齒類各一種，以便于更全面地了解受試物的毒效應。本文檔共127頁；當前第47頁；編輯于星期二\2點41分（3）實驗時選用健康、年幼的動物，小鼠體重為14~17g，大鼠體重50~80g，家兔和貓體重1~2kg，狗體重5~8kg。各試驗組動物體重均值應相近，各動物體重不應超過組平均體重的±20％。（4）大鼠各組不少于20只；家兔、貓、狗等較大動物，每組不應少于4~6只，雌雄各半。至少設3個劑量組和一個對照組。本文檔共127頁；當前第48頁；編輯于星期二\2點41分2.染毒劑量及實驗期限適宜的劑量為高劑量組能引起明顯中毒反應，但不引起很多動物死亡；低劑量組不引起任何中毒反應；介于二者之間的為中間劑量組。另設一組對照組。一般用LD50(LC50)的1／80~1／50作為亞慢性試驗劑量。試驗期限隨目的和要求或動物不同而異，大鼠可90d，較大的動物可4~6月。本文檔共127頁；當前第49頁；編輯于星期二\2點41分3.染毒途徑亞慢性毒性試驗中接觸外來化合物的途徑，應盡量模擬人類在環(huán)境中實際接觸的方式或途徑，此外還應與預期進行慢性毒作用試驗的接觸途徑相一致。亞慢性試驗中動物接觸外來化合物的途徑，主要是經(jīng)胃腸道(經(jīng)口)、呼吸道及皮膚接觸。本文檔共127頁；當前第50頁；編輯于星期二\2點41分4.觀察指標(1)一般綜合指標觀察動物的一般活動、癥狀和死亡情況，每周稱重一次，記錄飼料或飲水量，計算生長率(各組每周攝入食量與體重增加量之比)，并計算臟器濕重與單位體重的比值(臟器系數(shù))。(2)血液及生化檢驗主要指血清和肝、腎功能的檢驗。常規(guī)項目包括血紅蛋白、紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)、血小板數(shù)、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血清尿素氮等。本文檔共127頁；當前第51頁；編輯于星期二\2點41分(3)病理組織學檢查在外來化合物的亞慢性毒作用試驗中應重視病理組織學檢查，必要時還可進行組織化學和電鏡檢查。實驗過程中解剖死亡或瀕死動物。實驗結(jié)束時，處死所有動物進行尸檢。如未見明顯病變，可將高劑量組和對照組的主要臟器進行病理學檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對較低劑量相應器官組織進行檢查。本文檔共127頁；當前第52頁；編輯于星期二\2點41分5.試驗評價由試驗結(jié)果可對受試物的主要作用、靶器官和最大無作用水平及中毒閾劑量作出初步估計，并為進一步開展慢性毒性試驗提供依據(jù)。本文檔共127頁；當前第53頁；編輯于星期二\2點41分(二)慢性毒性試驗慢性毒性試驗是指以低劑量外來化合物，長期與試驗動物接觸，觀察其對試驗動物所產(chǎn)生的生物學效應的試驗。通過慢性毒性實驗，可確定最大無作用劑量，為制訂人體每日允許攝人量(AllowableDailyIntake，ADI)和最高容許濃度(MaximamAllowableConcentration，MAC)提供毒理學依據(jù)。本文檔共127頁；當前第54頁；編輯于星期二\2點41分1．哺乳動物的慢性毒性試驗(1)試驗動物及分組試驗動物的年齡應低于亞慢性試驗，選用斷乳的動物，如小鼠出生后三周之內(nèi)，體重10—12g；大鼠出生后3--4周，體重50～70日為宜。試驗動物的性別一般要求雌雄各半。設置3--4劑量組和1對照組，其他要求同亞慢性實驗。本文檔共127頁；當前第55頁；編輯于星期二\2點41分(2)染毒劑量和實驗期限

高劑量組應引起明顯的毒性反應，低劑量組應不引起毒性作用，在此兩組中間再設1-2個劑量組，可根據(jù)亞慢性實驗資料，取其最低中毒劑量的1／10、1／20、及1／50(或LD50的1／100~1／20中取3~4個劑量)作為慢性試驗劑量。試驗期限為1~12個月，如包括致痛實驗應18~24個月。本文檔共127頁；當前第56頁；編輯于星期二\2點41分(3)染毒途徑同亞慢性毒性試驗。(4)觀察指標

基本同亞慢性實驗，另作如下要求：①在試驗的第一個月，每周稱體重一次；4~6個月期間，每兩周稱體重一次；以后每4周稱重一次。②每兩個月進行一次血液學及其他生長指標的測定。一般可從各組每種性別中任取6~10只進行測定。③對病理檢查作半定量的評定，即除對剖檢及組織學檢查加以詳細描述外，還需根據(jù)病變程度加以分級評分(表3-7)。本文檔共127頁；當前第57頁；編輯于星期二\2點41分(5)試驗評價通過慢性毒性試驗所獲得的結(jié)果，對受試物在低劑量長時間接觸機體時所引起的毒性作用有更深入了解，可依據(jù)敏感觀察指標出現(xiàn)異常的最小閾劑量，找出該受試物慢性毒作用的最大無作用劑量，為受試物能否應用或為制訂其在環(huán)境中衛(wèi)生標準，提供重要的參考依據(jù)。本文檔共127頁；當前第58頁；編輯于星期二\2點41分本文檔共127頁；當前第59頁；編輯于星期二\2點41分2.水生生物的慢性毒性試驗將試驗種群連續(xù)暴露在不同濃度的化學物質(zhì)中（足夠長的時間），每個種群在規(guī)定的時間內(nèi)觀察其死亡率、產(chǎn)卵率、孵化率、幼體成活率、體長及體重的變化，與對照進行比較。本文檔共127頁；當前第60頁；編輯于星期二\2點41分四、蓄積毒性試驗(一)基本概念

低于中毒閥劑量的外來化合物，反復多次地與機體持續(xù)接觸，經(jīng)一定時間后使機體出現(xiàn)明顯的中毒表現(xiàn)，即為蓄積毒性作用。蓄積毒性作用是由于外來化合物進入機體的速度大于有機體消除的速度，而使外來化合物在體內(nèi)的量不斷累積，達到了使機體引起毒性作用的閾劑量所致。本文檔共127頁；當前第61頁；編輯于星期二\2點41分1.物質(zhì)蓄積

環(huán)境污染物不斷進入機體內(nèi)，其吸收量大于排出量，使其在體內(nèi)的量逐漸積累增多。2.功能蓄積

不斷進入機體內(nèi)的環(huán)境污染物，引起機體一定結(jié)構或功能的變化，并逐漸累積加重，最后導致出現(xiàn)損害作用。3.相互關系在物質(zhì)蓄積的情況下，肯定存在機體一定結(jié)構和功能的改變，而功能改變的累積也必須以物質(zhì)累積為基礎，兩者同時存在，互為基礎，無法嚴格加以區(qū)別。本文檔共127頁；當前第62頁；編輯于星期二\2點41分(二)蓄積試驗的研究方法1.蓄積系數(shù)法蓄積系數(shù)(K)：分次給受試物后，引起50％受試動物出現(xiàn)某種毒效應的總劑量(∑LD50(n))與一次給受試物后引起50％受試動物出現(xiàn)同一毒效應的劑量(LD50(1))的比值。本文檔共127頁；當前第63頁；編輯于星期二\2點41分（1）蓄積系數(shù)的強度級本文檔共127頁；當前第64頁；編輯于星期二\2點41分（2）測定蓄積系數(shù)的實驗方法固定劑量每天連續(xù)染毒法對受試動物以1/10~1/20LD50的固定劑量，每天染毒一次，觀察記錄動物死亡情況。當染毒劑量累計達到5個LD50（1）以上時，若受試動物死亡數(shù)未超過半數(shù)，此時的蓄積系數(shù)已大于5，表明該受試物的蓄積作用不明顯。如果染毒過程動物相繼陸續(xù)死亡，記下受試物出現(xiàn)50％死亡時累計的染毒總劑量，按上述算式計算蓄積系數(shù)。本文檔共127頁；當前第65頁；編輯于星期二\2點41分劑量定期遞增染毒法取一組受試動物，每天染毒一次，以4天為一期，開始的第一期每天染毒的劑量為1/10LD50(1)，隨后染毒的劑量每隔4天按1．5倍遞增一次，計算得定期給予的劑量數(shù)(表3-9)。本文檔共127頁；當前第66頁；編輯于星期二\2點41分在實驗過程中，逐日記錄動物的死亡情況，若連續(xù)染毒已達20天，此時每天的染毒劑量達0.5LD50，累計總劑量達5.30LD50，如果受試動物死亡未達50%，則表示該受試物的蓄積作用不明顯，試驗可終止。如果受試動物出現(xiàn)死亡達50%時，此時的累計染毒總劑量就是所求的蓄積系數(shù)。本文檔共127頁；當前第67頁；編輯于星期二\2點41分2.20天蓄積試驗法按LD50的1/20、1/10、1/5、1/2及對照隨機分成5組，每天對動物進行染毒，連續(xù)20d。各組總劑量分別為1、2、4、10LD50。觀察停藥后7d內(nèi)的死亡情況。如1/2LD50組有死亡，且各劑量組呈劑量—反應關系，則可認為受試物有較強的蓄積作用；若1/20LD50組有死亡但以上各劑量組有劑量—反應關系，則認為有中等蓄積作用；如1/20LD50組無死亡，而以上各劑量組又無劑量應關系，則認為無明顯的蓄積作用。本文檔共127頁；當前第68頁；編輯于星期二\2點41分3.受試物生物半減期測定法生物半減期(T1/2)是指外來化合物在體內(nèi)消除到原有濃度(量)的一半所需要的時間。生物半減期越長的物質(zhì)，越不易由體內(nèi)消除，其蓄積作用的可能性就越大。因測定外來化合物在體內(nèi)的生物半減期過程較為復雜，所以在實際觀測中常常僅以間接測定其在血液、尿液或器官組織中原有濃度(或量)降低一半所需的時間，以代表該物質(zhì)的生物半減期。本文檔共127頁；當前第69頁；編輯于星期二\2點41分式中：Yl和Y2分別為給受試物后于t1和t2時間測得該物質(zhì)的濃度或量。根據(jù)測得的生物半減期的長短，可以判定受試物的蓄積作用。生物半減期越長蓄積作用越大，反之則越小。本文檔共127頁；當前第70頁；編輯于星期二\2點41分第三節(jié)生物的分子和細胞水平檢測一、加和物測定（一）DNA加合物的測定■化學物質(zhì)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化，與DNA鏈的特異位點結(jié)合，形成共價結(jié)合物?！鲎饔梦稽c：鳥嘌呤的N-7位，O-6位；腺嘌呤的N-1位或N-3位■測定方法：免疫法、熒光法和32P-后標記法本文檔共127頁；當前第71頁；編輯于星期二\2點41分1.免疫法（1）基本原理■用熒光素、酶、放射性同位素等對抗體或抗原進行標記?！鰳擞涍^程即保持抗原或抗體的免疫活性，又不影響標記物本身的特性（如酶活性）?！鰧⑺鳛橐环N檢測試劑，與相應的抗原或抗體作用。■通過檢測標記物來觀察抗原抗體反應。本文檔共127頁；當前第72頁；編輯于星期二\2點41分（2）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）步驟■包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附結(jié)合到固體載體表面，使抗原或抗體固相化；■抗原抗體反應：先后加入被檢標本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應而被結(jié)合固定，經(jīng)洗滌除去游離的酶結(jié)合物?！雒复俜磻涸诜磻w系中，加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應而顯色。本文檔共127頁；當前第73頁；編輯于星期二\2點41分酶促反應二抗一抗抗原本文檔共127頁；當前第74頁；編輯于星期二\2點41分（3）放射免疫分析（RIA）radioimmunoassay■原理以放射性同位素標記抗原（Ag），采用飽和分析法檢測抗原。將求抗體（Ab）的化學量轉(zhuǎn)為求其放射性強度。靈敏度大為提高，可測至ng至pg水平。本文檔共127頁；當前第75頁；編輯于星期二\2點41分放射免疫測定原理示意圖本文檔共127頁；當前第76頁；編輯于星期二\2點41分2.熒光法■原理通過某些化合物的DNA-加合物具熒光特性而進行定量。■技術同步熒光法、低溫激光法、激光-發(fā)射熒光法?！鰞?yōu)點不破壞DNA鏈，并可區(qū)分出加合物的不同立體異構體及DNA鏈不同位點上的加合物。本文檔共127頁；當前第77頁；編輯于星期二\2點41分熒光抗體技術本文檔共127頁；當前第78頁；編輯于星期二\2點41分3.32P-后標記法■32P-后標記法原理將分離出的DNA用一定的酶水解成正常的單核苷酸和形成了加合物的單核苷酸，將二者分離，再用32P標記的ATP將帶有加合物的單核苷酸標記，然后用雙相層析、放射自顯影、液閃計數(shù)等方法定量?！鰞?yōu)點檢測能力強，應用范圍廣，可檢測任何化學物與DNA的連接，高靈敏性。本文檔共127頁；當前第79頁；編輯于星期二\2點41分（二）蛋白加合物的測定■各種蛋白質(zhì)亦可作為大分子形成化學物質(zhì)加合物?！鲅t蛋白（Hb）可與50多種化學物質(zhì)反應。■血紅蛋白的生存期120d，Hb-加合物可作為中長期暴露的指標。本文檔共127頁；當前第80頁；編輯于星期二\2點41分二、一般代謝酶的活性測定生物受到亞致死劑量毒物的暴露時，不僅可借助于酶指標來對毒物進行生化水平上的評價，還可用來探討毒物的作用機制。1.乙酰膽堿酯酶(Ache)活性測定■Ache活性作為有機磷農(nóng)藥污染的指標■測定方法Ellman比色法（p.113）放射測量法等本文檔共127頁；當前第81頁；編輯于星期二\2點41分2.ATPase活性測定■腺苷三磷酸酶（ATPase）可水解ATP，釋放出供生命活動所用的能量?！鰷y定方法Matsumura等的方法，用鉬藍法測定經(jīng)酶水解的無機磷。本文檔共127頁；當前第82頁；編輯于星期二\2點41分三、解毒系統(tǒng)酶類誘導作用的檢測混合功能氧化酶的誘導作用■直接法直接測定MFO的各組成成分如：細胞色素P450含量■代謝法測定MFO催化反應中的底物消耗量或產(chǎn)物生成量■使用單一方法進行MFO的評價不夠全面和可靠，在毒理學中常采用多種檢測分析方法，從不同角度進行MFO作用的評定。本文檔共127頁；當前第83頁；編輯于星期二\2點41分四、抗氧化防御系統(tǒng)檢測1.過氧化氫酶(CAT)活性測定■CAT能催化分解細胞代謝產(chǎn)生的H2O2，在調(diào)節(jié)細胞免于死亡的過程中起著重要作用?！鯟AT測定測量由H2O2分解所釋放出的氧，在240nm波長測定H2O2的吸光度變化、電化學測定H2O2或容量法滴定剩余的H2O2等方法。本文檔共127頁；當前第84頁；編輯于星期二\2點41分2.谷胱甘肽過氧化酶(GPx)活性測定■生物學作用：清除脂類過氧化物和H2O2■測定方法直接法：直接測定GSH減少量，GSH在255nm處呈最大吸收，故從255nm吸光值減少量可計算GSH的消耗量。間接法：利用H2O2或有機過氧化物氧化GSH，同時加入NADPH及谷胱甘肽還原酶，使氧化的GSH重新轉(zhuǎn)變?yōu)镚SH，而NADPH轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADP+，測定NADP+在340nm的吸光值可確定酶活性。本文檔共127頁；當前第85頁；編輯于星期二\2點41分第四節(jié)致突變、致畸和致癌效應檢測一、致突變效應(一)基本概念狹義的突變僅指基因突變，而廣義的突變包括染色體畸變和基因突變。致突變作用:某些物質(zhì)引起生物體的遺傳物質(zhì)發(fā)生基因結(jié)構改變的作用。致突變物:具有引起生物體基因突變的物質(zhì)。致突變物作用于生殖細胞可導致2種結(jié)果：

顯性致死突變、非致死性突變本文檔共127頁；當前第86頁；編輯于星期二\2點41分(二)試驗方法1.體外基因突變試驗(1)Ames試驗Ames試驗也稱鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗法。利用一種突變型微生物菌株與被檢化學物質(zhì)接觸，如該化學物具有致突變性，則可使突變性微生物發(fā)生回復突變，重新成為野生型微生物。正向突變野生型微生物突變型微生物（營養(yǎng)缺陷型微生物）回復突變本文檔共127頁；當前第87頁；編輯于星期二\2點41分(2)哺乳動物體細胞株突變試驗■利用哺乳動物突變細胞株發(fā)生回復突變，確定受試物是否具有致突變性?！龀Ｓ玫募毎辏篤79、CHO、L5178YV79和CHO特點：■缺乏利用嘌呤堿的酶HGPRT(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)。■如果在培養(yǎng)基中加入具有毒性的嘌呤類似物6-硫代鳥嘌呤TG或8-氮雜鳥嘌呤AG等，由于細胞缺乏利用嘌呤的酶，在這種培養(yǎng)基上生長良好。本文檔共127頁；當前第88頁；編輯于星期二\2點41分■對于正常細胞，由于存在HGPRT，在上述培養(yǎng)基上，可利用TG或AG，致使細胞得不到所需的真正嘌呤堿，以致不能生長。■如果突變型細胞接觸了致突變物，即可發(fā)生回復突變成為正常細胞，此時又具有了利用嘌呤堿的酶，因此像正常細胞一樣具有利用毒性的嘌呤堿類似物，以致中毒細胞不能在培養(yǎng)基上生長。借此可能確定突變細胞株是否發(fā)生了回復突變，可確定受試物是否具有致突變性。本文檔共127頁；當前第89頁；編輯于星期二\2點41分2.染色體畸變試驗

利用光學顯微鏡直接觀察生物體細胞在受到致突變物作用后，染色體發(fā)生數(shù)目和結(jié)構改變的情況。■檢測細胞CHO細胞外周血淋巴細胞本文檔共127頁；當前第90頁；編輯于星期二\2點41分細胞周期本文檔共127頁；當前第91頁；編輯于星期二\2點41分核小體和染色質(zhì)本文檔共127頁；當前第92頁；編輯于星期二\2點41分染色體本文檔共127頁；當前第93頁；編輯于星期二\2點41分有絲分裂本文檔共127頁；當前第94頁；編輯于星期二\2點41分人的體細胞染色體本文檔共127頁；當前第95頁；編輯于星期二\2點41分■試驗方法將CHO細胞或人類外周血淋巴細胞于37度培養(yǎng)24或72h，同時加入受試物。收獲細胞前2h，加入秋水仙堿，使大量分裂細胞同步于分裂中期。經(jīng)離心得到細胞沉淀，經(jīng)固定、制片和染色，鏡檢有無染色體畸變。觀察計數(shù)各種類型畸變，如斷裂、缺失、易位及多處斷裂等。本文檔共127頁；當前第96頁；編輯于星期二\2點41分3.細胞遺傳學試驗——微核試驗■微核:是染色單體或染色體的無著絲點斷片或因紡錘體受傷而失去的整個染色體，在分裂后期，仍留在細胞質(zhì)中，或因核膜受損后，核物質(zhì)向外突出延伸形成的一個或幾個有規(guī)則的圓形或橢圓形小體，其嗜染性與細胞核相似，比主核小，故稱微核。■一切發(fā)生分裂的細胞，在染色體斷裂劑作用下，均能產(chǎn)生微核，因此可用微核率的變化來檢測誘變物。本文檔共127頁；當前第97頁；編輯于星期二\2點41分4.體內(nèi)基因突變試驗(1)顯性致死突變試驗

（DominantLethalMutationTest）■檢測外來化合物對動物生殖細胞染色體的致突變作用?！鱿到y(tǒng)觀察胎鼠的成活情況因為哺乳動物生殖細胞染色體發(fā)生突變時（染色體斷裂或重組），往往不能與異性生殖細胞結(jié)合，或使受精卵在著床前死亡和胚胎早期死亡。本文檔共127頁；當前第98頁；編輯于星期二\2點41分(2)果蠅伴性隱性致死試驗■遺傳學原理致突變物可能在雄性果蠅配子X染色體上誘導隱性致死突變?！鰧⒔?jīng)處理的雄蠅與未處理的雌蠅交配，F(xiàn)1代雌蠅帶有來自父本的具致死突變的X染色體。由于致死突變?yōu)殡[性，所以F1蠅仍能夠正常生長、發(fā)育和生殖?！鰧1雌蠅與子一代雄蠅交配，則將有半數(shù)雄合子是含有經(jīng)受試物處理的雄蠅的X染色體，此時X染色體上隱性致死基因得以表現(xiàn)，引起此雄蠅死亡。本文檔共127頁；當前第99頁；編輯于星期二\2點41分(3)姐妹染色單體交換試驗（SisterChromatideExchangeTest，SCE）■SCE可能與DNA的斷裂和重聯(lián)相關?！龊芏嗷瘜W致突變物或致癌物可以大幅度地增加SCE頻率?！鰧嶒灧椒ㄒ?-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）代替胸腺嘧啶核苷，DNA復制后，用熒光染料染色，可觀察到SCE。本文檔共127頁；當前第100頁；編輯于星期二\2點41分5.染色體損傷試驗—DNA修復合成試驗（UnscheduledDNASynthesis，UDS）■細胞對其損傷DNA具有修復能力?！黾毎c化學物質(zhì)接觸后，若能誘導DNA修復合成，即可據(jù)此推斷該化學物質(zhì)具有損傷DNA的潛力?！鰧嶒灧椒ㄓ昧u基脲抑制細胞周期中S期的DNA半保留復制，用標記的脫氧胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入法測定非S期DNA合成的3H-TdR量。本文檔共127頁；當前第101頁；編輯于星期二\2點41分二、致畸效應1.基本概念致畸作用（Teratogenesis）■胚胎在發(fā)育過程中，由于受到某種因素的影響，使胚胎的細胞分化和器官形成不能正常進行，而造成器官組織上的缺陷，并出現(xiàn)肉眼可見的形態(tài)結(jié)構異常者成為畸形?！龇材芤鹋咛グl(fā)育障礙而導致胎兒發(fā)生畸形的物質(zhì)稱為致畸物或致畸原（Teratogen）?！?000多種環(huán)境因素可引起動物和人的畸胎。本文檔共127頁；當前第102頁；編輯于星期二\2點41分致畸作用的毒理學特點■胚胎與致畸物接觸時，可因胚胎所處的發(fā)育階段不同而呈現(xiàn)不同的敏感性。如器官形成期?！霾煌N屬在致畸作用中呈現(xiàn)不同的敏感性。本文檔共127頁；當前第103頁；編輯于星期二\2點41分化學致畸作用機理■突變引起胚胎發(fā)育異常?！鰧毎纳L分化較為重要的酶類受到抑制?！瞿阁w正常代謝過程被破壞?！黾毎至堰^程的障礙：引起生殖細胞減數(shù)分裂中的不分離或細胞有絲分裂過程的障礙等，均可使某些細胞死亡。本文檔共127頁；當前第104頁；編輯于星期二\2點41分2.試驗方法■動物選擇動物對受試物的代謝過程應基本上與人類相似（大鼠、小鼠和家兔）?！鰟┝糠纸M采用鼠類為實驗動物，每組不少于15-20只，一般劑量為LD50的1/3-1/2為高劑量組，LD50的1/30-1/100為低劑量組?！鍪茉噭游锾幚恚菏茉?，灌胃方法染毒■受試動物解剖：胎仔外部檢查、骨骼檢查內(nèi)臟檢查等。本文檔共127頁；當前第105頁；編輯于星期二\2點41分三、致癌效應1.基本概念■化學致癌作用化學物質(zhì)引起腫瘤的過程■化學致癌物能誘發(fā)腫瘤的化學物質(zhì)本文檔共127頁；當前第106頁；編輯于星期二\2點41分細胞癌變學說（1）體細胞突變學說認為致癌因素包括化學、物理、生物因素等，作用于體細胞的遺傳物質(zhì)DNA，使其發(fā)生了突變，其結(jié)果使細胞的功能發(fā)生異常改變而致癌，即癌變形成的基礎是體細胞發(fā)生了突變。本文檔共127頁；當前第107頁；編輯于星期二\2點41分（2）分化障礙學說認為細胞癌變不一定需要體細胞遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，而只是分化過程中有關基因調(diào)控過程受到致癌因素的干擾，使細胞分化和增殖發(fā)生紊亂而出現(xiàn)癌變。本文檔共127頁；當前第108頁；編輯于星期二\2點41分（3）癌基因?qū)W說認為所有細胞DNA分子中都存在有癌基因的遺傳信息，正常情況下它們處于阻遏狀態(tài)，只有細胞內(nèi)有關的調(diào)節(jié)機制遭到破壞后，癌基因才能表達，從而導致細胞發(fā)生癌變，形成腫瘤。本文檔共127頁；當前第109頁；編輯于星期二\2點41分癌變過程及其機理——癌的形成3階段■引發(fā)階段通過致癌物的作用，使正常細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞的過程。■促長階段經(jīng)過引發(fā)的癌細胞不斷增殖直至形成一個臨床上可被檢出之腫塊的過程。■浸潤和轉(zhuǎn)移階段已形成的腫塊不斷發(fā)展，逐漸侵害周圍的正常組織，并擴散到較遠的部位。本文檔共127頁；當前第110頁；編輯于星期二\2點41分2.試驗方法■致癌試驗是檢驗受試物及其代謝產(chǎn)物是否具有致癌作用或誘發(fā)腫瘤作用的慢性毒性試驗方法?！龇椒ǘ唐诤Y選方法長期動物誘癌試驗本文檔共127頁；當前第111頁；編輯于星期二\2點41分（1）短期篩選方法利用哺乳動物細胞體外轉(zhuǎn)化，觀察培養(yǎng)細胞與各種化學或物理致癌劑接觸后發(fā)生一系列表型改變，在通過增殖，這些表型變異的細胞形成與正常細胞不同的集落，即轉(zhuǎn)化集落。通過轉(zhuǎn)化集落的存在和轉(zhuǎn)化集落形成率以及轉(zhuǎn)化細胞接種裸鼠中發(fā)生腫瘤來評價化學物的致癌活性。本文檔共127頁；當前第112頁；編輯于星期二\2點41分（2）長期動物誘癌試驗■試驗動物及飼料要求選用抗病力強、容易飼養(yǎng)、腫瘤自發(fā)率低、對受試物敏感的動物?！鰟┝糠纸M及染毒途徑和期限設對照組、最大耐受劑量組和2個中間劑量組?！鲇^察指標一般檢查、腫瘤發(fā)生、病理學檢查、潛伏期、平均腫瘤數(shù)等■結(jié)果判斷本文檔共127頁；當前第113頁；編輯于星期二\2點41分第五節(jié)微宇宙法一、微宇宙法簡介微宇宙(Microcosm)法