本科生《P》5第五章目的基因制備與克隆策略3

第五章基因工程工具酶TheTooloftheGeneEngineering

教學目的與要求：1）掌握II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割原理，和部分常用識別位點。2）掌握常作DNA聚合酶的特性和用途。3）了解DNA連接酶和修飾酶在基因操作中的用途。1本文檔共56頁；當前第1頁；編輯于星期三\5點46分第一節(jié)目的基因的制備

2目的基因（TargetGene）：指基因工程中需要進行制備、克隆或利用的基因。制備目的基因要根據(jù)需要獲得DNA片段，可能是啟動子、終止子、內(nèi)含子，或者是編碼某種蛋白完整的序列。目的基因制備方法有直接分離法、基因文庫篩選法、PCR擴增法以及化學合成法等。一、目的基因的直接分離法1．限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法這是最簡單的獲取目的基因的方法，主要是從質粒、病毒等比較簡單的DNA分子或基因組中分離目的基因。無論是已知序列或是尚未測序的序列都可進行分離，只要確定目的基因兩側的酶切位點，就可用相應的酶進行切割，獲得目的基因。本文檔共56頁；當前第2頁；編輯于星期三\5點46分32.基因分離的物理化學法其原理是根據(jù)基因的DNA分子兩條鏈GC含量差異較大，理化性質、包括浮力密度和解鏈溫度明顯不同所采用相應的方法進行分離。（1）密度梯度離心法將DNA切割成適當片段，富含GC的雙鏈DNA片段浮力密度大，利用密度梯度超速離心技術，可將DNA片段按不同密度大小分開。（2）單鏈酶解法基因GC含量高（三個氫鍵），Tm值高，熱穩(wěn)定性高，可通過控制解鏈溫度使富含A=T區(qū)變性解鏈，GC區(qū)維持雙鏈狀態(tài)，再利用單鏈核酸酶S1酶切單鏈部分，獲得富含GC的基因片段。（3）分子雜交法利用DNA單鏈易與互補鏈形成雙鏈的原理，將已知基因DNA與目的生物的DNA進行復性，再用單鏈核酸酶S1酶切除單鏈，留下的雙鏈即為目的基因序列本文檔共56頁；當前第3頁；編輯于星期三\5點46分43.雙抗體免疫法分離編碼蛋白基因

基因翻譯過程中，核糖體沿mRNA進行多肽鏈合成時形成多聚核糖核蛋白體。利用多肽鏈制備的抗體及二抗，與多聚核糖核蛋白體一起溫育，目的基因的多聚核糖核蛋白體將通過抗原抗體反應與相應抗體形成復合物，利用不連續(xù)蔗糖梯度離心將此復合物分離出來，再通過酚/仿抽提法出去蛋白質部分，過oligo-dT柱層析，即可分離出特定蛋白編碼的mRNA，反轉錄即可得到cDNA。目前，可用金黃色葡萄球菌中分離的proteinA代替二抗，再用proteinA-Sepharose4B作親和層析，分離出特定的多聚核糖體（代替密度梯度離心）。

本文檔共56頁；當前第4頁；編輯于星期三\5點46分54．利用酶促反轉錄直接從特定mRNA分離基因此法是在目的基因的mRNA占細胞中總mRNA量很大時采用，直接用逆轉錄酶合成cDNA，與載體重組后導入受體菌擴增，獲得目的基因的cDNA克隆。如哺乳動物的網(wǎng)織紅細胞中珠蛋白mRNA占總mRNA的90%以上，用此法克隆了該基因。本文檔共56頁；當前第5頁；編輯于星期三\5點46分65．構建基因文庫分離目的基因基因文庫分基因組文庫和cDNA文庫?；蛭膸炜捎觅|粒載體、噬菌體載體、柯斯質粒（cosmid）載體和酵母人工染色體（YAC）載體進行構建。從基因組文庫可以分離獲得基因編碼序列、調(diào)控序列、啟動子、終止子、核糖體識別mRNA序列、ARS、端粒序列、間隔序列等，可用于基因結構分析、基因表達和調(diào)控研究等。cDNA文庫來自于模板mRNA的核苷酸序列，只能反映基因表達的轉錄及加工后mRNA產(chǎn)物所攜帶的信息，所以從cDNA文庫可以分離到基因的編碼序列。本文檔共56頁；當前第6頁；編輯于星期三\5點46分7篩選基因文庫的方法：①已知基因序列，可以人工合成核酸探針，通過核酸雜交，從基因文庫中篩選出含目的基因的克隆。②已分離純化某蛋白，并知其氨基酸序列，根據(jù)氨基酸序列合成寡聚核苷酸序列作為探針，篩選基因文庫。③已純化某蛋白，未能測出其氨基酸序列，可以該蛋白制備抗體，從cDNA表達文庫中篩選出含該蛋白編碼基因的克隆。④對編碼產(chǎn)物未知的基因，采用特殊分離方法如差別顯示技術、差減雜交法、遺傳互補法等。本文檔共56頁；當前第7頁；編輯于星期三\5點46分8遺傳互補法（功能互補法）原理：當把一外源DNA片段引入一受體細胞后，如果受體細胞獲得某種新的性狀，那么此片段上攜帶著決定新性狀的遺傳基因。必備條件：外源基因不僅能在受體細胞表達，而且必須具備生物學活性。營養(yǎng)缺陷型受體細胞+外源DNA→轉化細胞涂布在合成培養(yǎng)基上→原養(yǎng)型細胞生長受體細胞（無某種表型）+外源DNA→轉化細胞涂布在特殊培養(yǎng)基上→具有新性狀細胞雖然有些受體細胞也能產(chǎn)生某種酶活性，但當轉入目的基因后，該細胞可過量產(chǎn)生此酶活性，這亦可用于基因篩選。如釀酒酵母的MFα基因就是如此篩選到的。實例：基因組文庫DNA→轉化釀酒酵母細胞（leu2,Leu-）→轉化細胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因基因組文庫DNA→轉化E.coli（無纖維素酶活性）→轉化細胞可在纖維素平板上形成水解圈→纖維素酶基因本文檔共56頁；當前第8頁；編輯于星期三\5點46分9核酸雜交法（同源序列克隆法）：（1)原理利用核酸探針與待分離DNA的同源序列可進行雜交的特點分離目的基因。（2)核酸探針種類①DNA探針:分離自某一種生物。②寡核苷酸探針:根據(jù)目的基因編碼蛋白質的部分氨基酸序列推測，人工化學合成。如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN對應mRNAN：ACGT/UCAN-AAP-GTP-CTP-CG探針序列Q：CT/UP：AG32種14聚體的混合物，其中必有一種與待測DNA完全互補。cDNA探針:利用特異性mRNA反轉錄而成，亦可用不同mRNA混合物反轉錄而成。RNA探針:由T3或T7啟動子和相應聚合酶轉錄其下游基因片段而得。本文檔共56頁；當前第9頁；編輯于星期三\5點46分10分離步驟：基因文庫→制備DNA樣品膜→與標記探針雜交→雜交斑點（陽性克?。蛛x重組DNA分子→作斑點和Southern雜交以確認雜交結果→DNA進一步證實和鑒定：核酸序列分析，與蛋白質一級結構比較；分離插入片段進行基因表達，用免疫方法或其他方法檢測表達產(chǎn)物。6．特異性DNA片段(基因)的PCR擴增

本文檔共56頁；當前第10頁；編輯于星期三\5點46分114．目的基因的化學合成法（1）核酸片段化學合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法和亞磷酸三酯法，反應體系有液相和固相。目前常用的方法是固相亞磷酸三酯法。第一個核苷酸的3`端通過3`羥基與惰性固相載體上的間隔臂形成酯健，寡核苷酸按3`-5`方向進行化學合成，正常終產(chǎn)物是3`、5`端均帶有羥基的寡聚核苷酸。合成原料：經(jīng)化學修飾的核苷—亞磷酰胺。有兩種類型：①甲基化亞磷酰胺；②?-氰乙基-亞磷酰胺。合成時要對羥基、磷酸、氨基進行保護，合成結束后，去掉所有保護基團。固相載體：是對DNA合成試劑惰性的物質，目前采用可控孔徑的玻璃沙（CPG）,其表面的硅氧烷鍵可與A、G、C、T核苷的3`-羥基以酯鍵連接，該鍵可用29%濃氨水打斷。本文檔共56頁；當前第11頁；編輯于星期三\5點46分12反應分四步：1）二甲氧三苯甲基（DMT，羥基保護基團）的脫除用三氯乙酸（TCA）或二氯乙酸（DCA）處理，脫去連在固相載體上的核苷酸或寡核苷酸5`羥基的DMT保護基團。2）偶聯(lián)反應（縮合反應，加成反應）由溶于無水乙腈中的四唑催化，使亞磷酰胺單體的3`磷酸基團與固相載體上的5`羥基發(fā)生反應，形成亞磷酸三酯鍵。3）封閉反應加成反應剩下的亞磷酰胺，以N-甲基瞇唑催化，用乙酸酐使羥基乙?；?，封閉其羥基，防止在下一循環(huán)中發(fā)生加成反應。4）氧化反應在堿性條件下，以碘使加成反應形成的3`，5`亞磷酸三酯鍵氧化為穩(wěn)定的5價磷酸三酯。上述每循環(huán)一次，增加一個核苷酸，需7~9min。每一步反應完成都以乙腈清洗，氬氣吹干，保證無水環(huán)境。合成反應結束后，除去保護基團，29%濃氨水處理使寡聚核苷酸從載體上釋放出來，乙醇或異丙醇沉淀、回收DNA。用RNA亞磷酸胺單體和聚苯乙烯固相載體，合成RNA。本文檔共56頁；當前第12頁；編輯于星期三\5點46分13（2）化學合成DNA片段種類①DNA互補鏈合成引物包括PCR引物和測序引物。②DNALinker預先設計，通過化學合成的寡聚核苷酸片段，含有1種或幾種酶切位點，酶切可產(chǎn)生粘性末端。如果將含有多個酶切位點的Linker引入克隆載體中，就會形成多克隆位點（MCS），這種具有多克隆位點的連桿稱MCSLinker。③Adaptor是一種化學合成的寡聚核苷酸，含有一種以上的內(nèi)切酶位點。其與Linker的差別是Adaptor一端或兩端已有1種或兩種內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的粘性末端。④DNA芯片 指DNA片段以事先設計的排列方式固定在載波片或尼龍膜上組成的密集分子排列。固定的是探針，或者是靶DNA分子。本文檔共56頁；當前第13頁；編輯于星期三\5點46分14（3）目的基因的化學合成法1979年，Khorana等首次化學合成基因有生物活性。有全片段酶促連接法和酶促填充法。本文檔共56頁；當前第14頁；編輯于星期三\5點46分155．利用表達序列克隆目的基因（1）表達序列標簽法分離目的基因Expressedsequencetag，簡稱EST：指基因序列中一段能特異地標記或表征基因的序列，通常它含有足夠的結構信息以顯示出該基因與其他基因的差異，長度一般為100~500bp。利用EST尋找新基因的策略即為表達序列標簽法（ESTs）。最早由M.D.Adam在1991年建立并加以應用，有的文獻稱之為cDNA測序法?；静襟E如下：①從組織特異性或細胞特異性的cDNA文庫中隨機挑選克隆，進行5‘端和3’端部分序列（約400bp）的測定。②通過對GenBank、EMBL或其他核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進行聯(lián)機檢索，可以檢測出所測定序列及其對應的多肽氨基酸序列。將檢測的序列與基因庫中已知基因進行同源比較，可檢測到已知基因和未知基因。③通過基因文庫的篩選或基因定位的方法分離目的基因。表達序列標簽法分離目的基因有時可以從幾個不同基因的高度保守區(qū)得到相同的cDNA片斷，有時一個較大的基因不同外顯子又能表現(xiàn)為若干不同的cDNA。本文檔共56頁；當前第15頁；編輯于星期三\5點46分16（2）計算機克隆(siliconcloning)或生物信息學(bioinformatics)克隆新基因策略生物信息學克隆新基因策略是表達序列標簽法的延伸和發(fā)展。生物信息學與計算機科學、信息學等學科相互交叉而誕生的一門新興學科，核心內(nèi)容是通過對生物學實驗數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲、檢索與分析，進而達到揭示數(shù)據(jù)所蘊含的生物學意義的目的。做法：利用已發(fā)現(xiàn)的其他物種基因的cDNA序列為參照，在國際互聯(lián)網(wǎng)的EST數(shù)據(jù)庫（GebBank或EMBL等）中進行同源搜索，獲得一系列同源的或部分重疊的EST序列，然后用GCG、DNAstar軟件中的alignment程序將它們拼接成一個EST重疊群(contig)，經(jīng)過逐步延伸（cDNAsalking)及整合后可獲得全長的cDNA序列；根據(jù)該推測的序列，可合成相應的特異引物，進行PCR擴增后，即可獲得該基因的cDNA片斷。局限性：難以尋找到一些表達量極低或者不表達的新基因類型，克隆基因的功能也有待鑒定。本文檔共56頁；當前第16頁；編輯于星期三\5點46分17（3）基因表達系列分析法基因表達系列分析法(serialanalysisofgeneexpression,簡稱SAGE)可一次對大量基因轉錄產(chǎn)物進行定量分析，從中找出新的基因。原理（兩個）：①從轉錄物某一特定位置上分離得到一段9~10bp的寡核苷酸序列標簽(sequencetag,ST)，它含有確定的一個獨特轉錄物的足夠信息量，可代表此轉錄物的特異性。理論上隨機排列的9bp片斷可區(qū)分262144（49）種轉錄物，人類的基因約僅有80000個轉錄子，因此，9個核苷酸序列可以代表所有轉錄子的特征。②多個序列標簽（ST）能以錨定酶(anchoringenzyme,AE，識別位點為4堿基的限制性核酸內(nèi)切酶)識別位點序列相隔相互連成雙標簽序列(ditag)的多聯(lián)體，將該多聯(lián)體序列克隆到一個載體中，用連續(xù)的方法進行多聯(lián)體序列分析，再通過計算機處理，確定每一種序列（ST）代表轉錄產(chǎn)物的種類和出現(xiàn)頻率，由此實現(xiàn)對轉錄物的高效、快速和大量的分析。本文檔共56頁；當前第17頁；編輯于星期三\5點46分186．篩選目的基因片斷的差別雜交及減法雜交技術（1）差別雜交法差別雜交（differentialhybridization）或稱為差別篩選(differentialscreening)法，特別適用于分離在特定組織中、發(fā)育的特定階段表達的基因以及受生長因子調(diào)節(jié)的基因，亦可有效地用來分離經(jīng)特殊處理誘導表達的基因。方法是分別制備兩種不同細胞群體的mRNA提取物，其中一個群體含有一定比例的目的基因mRNA，另一個群體不含有目的基因mRNA。以這兩種總mRNA（或是它們的cDNA拷貝）為探針，分別對由表達目的基因的細胞群體構件的cDNA文庫進行篩選。本文檔共56頁；當前第18頁；編輯于星期三\5點46分19（2）減法雜交技術減法雜交（subtractivehybridization）又叫做差減雜交克隆、扣除雜交、減數(shù)雜交或消減雜交等，該技術是通過DNA復性動力學原理富集目的基因序列，并以此構建減數(shù)文庫(subtractivelibrary)的方式來進行目的基因克隆。減法雜交的對象可以是DNA，也可以是cDNA，相應地稱為基因組DNA減法雜交和mRNA減法雜交。后者分析差異表達的基因，適于某些低豐度mRNA的cDNA克隆。mRNA減法雜交原理：從表達目的基因的組織中提取mRNA并反轉錄為cDNA，然后與無目的基因表達的組織中提取mRNA做過量雜交，在兩種組織中均表達的基因產(chǎn)物形成cDNA/mRNA雙鏈雜交分子，而特異mRNA反轉錄的cDNA片段仍保持單鏈狀態(tài)，將這種單鏈cDNA分離出來即為差異表達的序列。本文檔共56頁；當前第19頁；編輯于星期三\5點46分20（3）基因表達系列分析法基因表達系列分析法(serialanalysisofgeneexpression,簡稱SAGE)可一次對大量基因轉錄產(chǎn)物進行定量分析，從中找出新的基因。原理（兩個）：①從轉錄物某一特定位置上分離得到一段9~10bp的寡核苷酸序列標簽(sequencetag,ST)，它含有確定的一個獨特轉錄物的足夠信息量，可代表此轉錄物的特異性。理論上隨機排列的9bp片斷可區(qū)分262144（49）種轉錄物，人類的基因約僅有80000個轉錄子，因此，9個核苷酸序列可以代表所有轉錄子的特征。②多個序列標簽（ST）能以錨定酶(anchoringenzyme,AE，識別位點為4堿基的限制性核酸內(nèi)切酶)識別位點序列相隔相互連成雙標簽序列(ditag)的多聯(lián)體，將該多聯(lián)體序列克隆到一個載體中，用連續(xù)的方法進行多聯(lián)體序列分析，再通過計算機處理，確定每一種序列（ST）代表轉錄產(chǎn)物的種類和出現(xiàn)頻率，由此實現(xiàn)對轉錄物的高效、快速和大量的分析。本文檔共56頁；當前第20頁；編輯于星期三\5點46分第二節(jié)目的基因克隆沒有任何一種克隆方法能夠涵蓋所有好處，克隆步驟：1）克隆一個基因的方法：cDNA合成限制性核酸內(nèi)切酶消化機械剪切Mechanicalshearing2）加到載體上：選擇寄主和載體系統(tǒng)平末端連接Blunt-endligation使用連接頭Useoflinkermolecules粘性末端連接Ligationofcohesivetermini同聚物尾巴Homopolymertailing3）IntroducingtherecombinantDNAintoahostcell：重組質粒轉化TransformationwithrecombinantplasmidDNA重組噬菌體DNA轉染TransfectionwithrecombinantphageDNADNA體外包裝PackagingDNAinvitro本文檔共56頁；當前第21頁；編輯于星期三\5點46分Chapter6第二節(jié)目的基因克隆ThereisnosinglecloningstrategythatwillcoverallrequirementsA.GenerationofgenefragmentB.JoiningtoavectorC.IntroducingtherecombinantDNAintoahostcellcDNAsynthesisRestrictionenzymedigestionMechanicalshearingChoosethehost/vectorsystemBlunt-endligationUseoflinkermoleculesHomopolymertailingLigationofcohesive

terminiTransformationwithrecombinantplasmidDNATransfectionwithrecombinantphageDNAPackagingDNAinvitro本文檔共56頁；當前第22頁；編輯于星期三\5點46分cDNAsynthesisRestrictionenzymedigestionMechanicalshearingDirectChemicalsymthesisPackagingDNAinvitroTransformationwithRecombinantPlasmidDNATranfectionwithRecombinantPhageDNABlunt-endligationUseoflinkermoleculesHomopolyertailingLigationofCohesiveterminiGenerationofgenefragmentChoosethehost/vectorsystemIntroducingtherecombinantDNAintoahostcellChapter6本文檔共56頁；當前第23頁；編輯于星期三\5點46分★看家基因（Housekeepinggenes）：又稱管家基因或持家基因：在所有細胞中均要表達的一類基因，其產(chǎn)物對維持細胞的基本結構和代謝功能是必不可少（forbasiccellularmetabolism），表達水平受環(huán)境因素影響較小，在各生長階段的大多數(shù)、或幾乎全部組織中持續(xù)表達，或變化很小。表達只受啟動序列或啟動子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機制調(diào)節(jié)。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等Housekeepinggenes:forbasiccellularmetabolism★每一個細胞都會生產(chǎn)大量的特殊的mRNA

Poly(A)+RNA:eachcelltypeproducedifferentabundanceclassesofparticularmRNAs.一、CloningfrommRNAChapter6本文檔共56頁；當前第24頁；編輯于星期三\5點46分★cDNA:complementaryDNA(copyDNA),poly(A)+RNAastempleReversetranscriptase=RTaseOligo(dT)primerAlkalinehydrolysis(orRNaseH)toremovemRNAstrandT4DNApolymerase,klenowfragmentS1nucleasetoproduceablunt-ended一、CloningfrommRNAChapter6本文檔共56頁；當前第25頁；編輯于星期三\5點46分mRNAAAAAAA-3’5’Chapter6RTaseHO-TTTTTT-5’AAAAAA-3’TTTTTT-3’TTTTTT-3’NaOHOHsscDNADNApolymeraseKlenowfragmentTTTTTT-3’S1nucleasedscDNASynthesisofcDNA本文檔共56頁；當前第26頁；編輯于星期三\5點46分mRNAAAAAAACCCC-3’5’TTTTTT-5’TTTTTT-5’AlkalinesucrosegradientdscDNAAAAAAA-3’5’TTTTTT-5’cDNA3’CTerminaltransferase+dCTP3’-CCCCCCRTaseTTTTTT-5’3’-CCCCCC5’-GGGGGGAddoligo(dG)primerChapter6Oligo（dG）-primedsecond-strandcDNAsynthesisCCCC3’-C本文檔共56頁；當前第27頁；編輯于星期三\5點46分★blunt-endligation:S1nuclease

destroytheprotrudingendsofDNA;

DNApolymerase(klenowfragment)fillingtheprotrudingendsofDNA.Maindisadvantage:1)isaninefficientprocess,requirehighconcentrationDNAforligation;2)vectorself-ligatetoproducecircularmolecules

ortheinsert/vectorDNAsmayformconcatemersinsteadofbimolecularrecombinants,usephoshpatase(eitherBAPorCIP)topreventself-ligation;3)cloningsitedisappearintherecombinantDNA2CloningcDNAinplasmidvectorsTwomethods:1)Ligationofblunt-end2)Ligationofcohesivetermini

a.Useoflinkermoleculesb.Homopolymertailing本文檔共56頁；當前第28頁；編輯于星期三\5點46分CCGAATTCGGGGCTTAAGCCLinkers:

areself-complementaryoligomersthatcontainarecognitionsequenceforaparticularrestrictionenzyme.DNAligaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCC5’-AATTCGG

GCCCCGGGCTTAA-5’EcoRI＋本文檔共56頁；當前第29頁；編輯于星期三\5點46分Adaptors:

aresingle-strandednon-complementaryoligomersthatmaybeusedinconjunctionwithlinkers,whenannealedtogetherandbeaddedtothecDNAtoprovidesticky-endcloningwithoutdigestionofthelinkers.OH-GATCCCCGGGDNAligaseCCCGGGGGGCCCCTAG-OH-5’GGGCCCGGATCCCCTAGGBamHI+OH-GATCCCCGGG

GGGCCC5’-OH-GATCCCCGGG

GGGCCCCCCGGG

GGGCCC

HpaII本文檔共56頁；當前第30頁；編輯于星期三\5點46分Homopolymertailing:

theenzymeterminaltransferaseisusedtoaddhomopolymersofdA,dT,dGordCtoaDNAmolecule.PstIvectorCCCCCCCC-3’3’-CCCCCCCCInsertCTGCAGGGGGGGG-3’G3’-GGGGGGGGACGTCGPstIsiteGGGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGGGGACGT

TGCAGCCCCCCCCCCCCCCCCPstIsiteEnzymedigestionTerminaltransferase+dCPstIdigestionTerminaltransferase+dGDNAligaseTargetgene本文檔共56頁；當前第31頁；編輯于星期三\5點46分★Mainadvantage:1)packaginginvitromaygeneratetherecombinantphage,whichincreasestheefficiencyofthecloningprocess.

2)mucheasiertostoreandhandlelargenumbersofphageclonesthanplasmids.3CloningcDNAinbacteriophagevectorsIfalargenumberofrecombinantswasrequired,andalow-abundancemRNAwastobecloned,phagevectorsmaybemoresuitable.本文檔共56頁；當前第32頁；編輯于星期三\5點46分CloningcDNAinλvectorsusinglinkers:EcoRImethylaseCCGAATTCGGGGCTTAAGCCAddEcoRIlinkersdscDNAMeMeCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCDigestwithEcoRILigateInsertvectorvectorLAλ

vectorRA本文檔共56頁；當前第33頁；編輯于星期三\5點46分★genomiclibrary:isoftenusedtodescribeasetofclonesrepresentingtheentiregenomeofanorganism.TodeterminetheintronsToexaminethecontrolsequencesresponsibleforregulatinggeneexpression二、CloningfromgenomicDNA1Genomiclibraries★aimofconstructingagenomiclibraryisforisolatingatargetDNAsequence.★

Clonebank(library):Acollectionofindependentclonesistermedaclonebankorlibrary本文檔共56頁；當前第34頁；編輯于星期三\5點46分估計基因組文庫大小的經(jīng)驗（empiricalformula）公式：

N=ln(1-P)/ln(1-a/b)N:thenumberofclonesrequiredP:desiredprobabilityofaparticularsequencebeingrepresented(0.95or0.99)a:theaveragesizeoftheDNAfragmenttobeclonedb:thesizeofthegenome本文檔共56頁；當前第35頁；編輯于星期三\5點46分organismGenomeSize(kb)No.clonesN,P=0.9520kbinserts45kbinsertsEscherichiacoli(bacteria)4.0×1036.0×1032.7×103Saccharomycescerevisiae(yeast)1.4×1042.1×1039.3×102Arabidopsisthaliana(simpleplant)7.0×1041.1×1044.7×103Drosophilamelanogaster(fruitfly)1.7×1052.5×1041.1×104Stroglyocentrotus

purpuratus(seaurchin)8.6×1051.3×1055.7×104Homosapiens(human)3.0×1064.5×1052.0×105Triticumaestivum(hexaploidwheat)1.7×1072.5×1061.1×106Geneticlibrarysizesforvariousorganisms本文檔共56頁；當前第36頁；編輯于星期三\5點46分選擇哪種載體用于基因組文庫構建？Whichvectorisusedtochooseforconstructionofgeneticlibrary?λphagevector：有效容納量是15kbcosmidvector：有效容納量是45kb本文檔共56頁；當前第37頁；編輯于星期三\5點46分建立基因組文庫的一般程序：1．載體DNA片段的制備載體DNA分離純化限制酶切脫磷酸化反應3.供體與載體DNA連接提高重組頻率，應注意連接反應體系中總DNA濃度和兩種DNA分子的摩爾數(shù)比率。2．供體DNA片段的制備機械剪切法總DNA分離純化分離特定大小DNA片段酶法（部分酶切、完全酶切）本文檔共56頁；當前第38頁；編輯于星期三\5點46分4.重組DNA分子的轉移和基因組文庫的擴增利用轉化或感染方法將連接好的重組DNA分子導入宿主細胞，讓其自主復制，重組DNA分子被擴增（重組子比率可能發(fā)生變化）。5.基因組文庫質量的評價1）文庫規(guī)模----隨機挑取一些轉化子或重組子，提取質粒DNA，電泳測定插入片段大小，然后根據(jù)上述公式計算文庫大小。2）重組頻率----頻率越高，質量越高，可大大減輕后續(xù)篩選基因工作量。本文檔共56頁；當前第39頁；編輯于星期三\5點46分CloningDNAinλvectorsusinglinkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvectorvector本文檔共56頁；當前第40頁；編輯于星期三\5點46分CloningDNAinλvectorsusinglinkers:CCGAATTCGGGGCTTAAGCCCCGAATTCGGGGCTTAAGCCInsertvectorvector本文檔共56頁；當前第41頁；編輯于星期三\5點46分ThemolecularweightoftheDNAafterisolationfromtheorganism.ThemethodusedtofragmenttheDNA.文庫的連接、包裝和擴增TwomainconsiderationwhenpreparingDNAfragmentforcloning:Foracompletelyrandomlibrary,DNAmolecularweightshouldbeveryhigh.

★100kbisavailable.★

Fragmentationcanbeachievedeitherbymechanicalshearingorbypartialdigestionwitharestrictionenzyme.本文檔共56頁；當前第42頁；編輯于星期三\5點46分CTAGAnnealBamHI

Sau3AGCCTAGGATCC

GGATC

CTAGGATC

GCCTAGGATC

CTAGGATCC

GCloningSau3AfragmentsintoBamHIsite本文檔共56頁；當前第43頁；編輯于星期三\5點46分5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHI

5’-NGATCN-3’3’-NCTAGN-5’Sau3AEBSEBSEMBL4LeftarmRightarmSSLeftarmRightarmS/BS/BGATCCTAGGATCCTAGLigationofSau3A–cutDNAintotheλreplacementvectorEMBL4本文檔共56頁；當前第44頁；編輯于星期三\5點46分5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHI

5’-NGATCN-3’3’-NCTAGN-5’Sau3AEMBL4

GATCCTAGGATCCTAGEBSEBSLeftarmRightarmStufferfragmentSSLeftarmS/BGATCCTAGGATCCTAGS/BRightarmInsertDNASau3AcohesiveendSau3Acohesive

endLigationofSau3A-cutDNAintotheλreplacementvectorEMBL4本文檔共56頁；當前第45頁；編輯于星期三\5點46分GATCCTAGGATCCTAGcoscosInsertInsertInsertcoscosLALALARARAPackagedinvitroConcatemericrecombinantDNAPrimarylibraryAmplificationoflibraryPlatingthepackagedphageonasuitablehostofE.coli,thenresuspendingtheplaquesbywashingtheplateswithabuffersolutionConcatemericrecombinantDNAandamplificationoflibrary

本文檔共56頁；當前第46頁；編輯于星期三\5點46分4.更先進的克隆技術Advancedcloningstrategies1)SynthesisandcloningofcDNAOkayama–Berg法1）T引物的合成：在質粒上進行，用于合成第一條cDNA鏈2）G引物的合成：在質粒上進行，用于合成第二條cDNA鏈3）第一條cDNA鏈合成：T引物與mRNA退火反轉錄反應4）第二條cDNA鏈的合成：

a.

第一條cDNA鏈3’-末端加尾（dCTP）b.

限制酶切除去載體上所加的多聚C尾巴c.與G引物退火d.

除去RNA

e.

合成第二條cDNA鏈5）cDNA文庫的形成—轉化

本文檔共56頁；當前第47頁；編輯于星期三\5點46分2)ExpressionofclonedDNAmoleculesPromoter（啟動子）:areregionswithaspecificbasesequence,towhichRNApolymerasewillbind.Strongpromoter:強啟動子Weakpromoter:弱啟動子Induciblepromoter:誘導型啟動子在原核生物中（Inprokaryoticpromoter）：Consensussequence:Inprokaryoticpromoter,twomainregionsisimportant:-10region=Pribnowbox:5’-TATAAT-3’-35region:5’TTGACA-3’本文檔共56頁；當前第48頁；編輯于星期三\5點46分真核生物中（Ineukaryoticpromoter）:Enhancers（增強子）:maybelocat