酶工程制藥醫(yī)學(xué)知識課件

第一節(jié)概述一、酶的基礎(chǔ)知識（一）酶是生物催化劑酶是生物細胞產(chǎn)生的、具有催化能力的生物催化劑。催化高效性：108~1020專一性：結(jié)構(gòu)專一性；立體異構(gòu)專一性酶具有不穩(wěn)定性（二）酶的化學(xué)本質(zhì)蛋白質(zhì)酶單純酶結(jié)合酶（全酶）=酶蛋白+輔因子輔因子輔酶與酶蛋白結(jié)合得牢固的小分子有機物。輔基與酶蛋白結(jié)合得松散的小分子有機物。金屬激活劑金屬離子作為輔助因子。3必需基團：這些基團若經(jīng)化學(xué)修飾使其改變，則酶的活性喪失?；钚圆课唬好阜肿又兄苯优c底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。必需基團活性部位維持酶的空間結(jié)構(gòu)結(jié)合基團催化基團專一性催化性質(zhì)二、現(xiàn)代酶工程的主要內(nèi)容：1.酶的分離純化、大批量生產(chǎn)及新酶和酶的應(yīng)用開發(fā)；2.酶和細胞的固定化及酶反應(yīng)器的研究，包括酶傳感器、反應(yīng)檢測；3.酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶的研究；4.酶的分子改造和化學(xué)修飾，結(jié)構(gòu)與功能的研究；5.有機相中酶反應(yīng)的研究；6.酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)與應(yīng)用研究；7.抗體酶、核酸酶的研究；8.模擬酶、合成酶及酶分子的人工設(shè)計、合成研究。三、酶的來源和生產(chǎn)（一）酶的來源

酶的生產(chǎn)目前多數(shù)直接從生物體中提取分離。非常少的是合成或基因工程生產(chǎn)的。早期酶的生產(chǎn)：以動植物為主要原料，如激肽釋放酶（胰臟）、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶。近10年來，研究發(fā)展了動植物組織培養(yǎng)技術(shù)，但周期長、成本高。工業(yè)生產(chǎn)一般都以微生物為主要來源。微生物生產(chǎn)酶的特點1.微生物種類繁多，凡是動植物體內(nèi)存在的酶，幾乎都能從微生物中得到；2.微生物繁殖快、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)簡便，并可通過控制培養(yǎng)條件來提高酶的產(chǎn)量；3.微生物具有較強的適應(yīng)性，通過各種遺傳變異的手段，能培育出新的高產(chǎn)菌株。四、酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用1.在疾病診斷方面的應(yīng)用由于酶具有專一性強、催化效率高、作用條件溫和等催化特點，酶學(xué)診斷已經(jīng)發(fā)展成為可靠、簡便又快捷的診斷方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。酶學(xué)診斷方法：1）是根據(jù)體內(nèi)原有酶活力的變化來診斷某些疾??；2）利用酶來測定體內(nèi)某些物質(zhì)的含量，從而診斷某些疾病。9①根據(jù)體內(nèi)酶活力的變化診斷疾病:一般健康人體內(nèi)所含有的某些酶的量是恒定在某一范圍的。當人們患上某些疾病時，則由于組織、細胞受到損傷或者代謝異常而引起體內(nèi)的某種或某些酶的活力發(fā)生相應(yīng)的變化。故此，可以根據(jù)體內(nèi)某些酶的活力變化情況，而診斷出某些疾病。胰腺癌：胰蛋白酶、胰型同工酶等升高肝炎：轉(zhuǎn)氨酶升高

11②用酶測定體液中某些物質(zhì)的變化診斷疾?。喝梭w在出現(xiàn)某些疾病時，由于代謝異?；蛘吣承┙M織器官受到損傷，就會引起體內(nèi)某些物質(zhì)的量或者存在部位發(fā)生變化。通過測定體液中某些物質(zhì)的變化，可以快速、準確地對疾病進行診斷。酶具有專一性強、催化效率高等特點，可以利用酶來測定體液中某些物質(zhì)的含量變化，從而診斷某些疾病。2.在疾病治療方面的應(yīng)用-酶類制劑

①酶可以作為藥物治療多種疾病，用于治療疾病的酶稱為藥用酶。②藥用酶具有療效顯著，副作用小的特點，在疾病的治療方面的應(yīng)用越來越廣泛。溶菌酶：抗菌消炎和鎮(zhèn)痛1）消化類：

研究最早，是品種最多的一類酶。在這一類酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纖維素酶、木瓜酶、凝乳酶、無花果酶、菠蘿酶等。健美生消化酶—幫助腸胃蠕動2）抗炎凈創(chuàng)類：目前在治療上發(fā)展最快，用途最廣的一種。多數(shù)是蛋白質(zhì)水解酶，分解發(fā)炎部位纖維蛋白的凝結(jié)物，消除傷口周圍的壞疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能夠分解膿液中的核蛋白使生成簡單的嘌呤和嘧啶，降低膿液的粘性、達到凈潔創(chuàng)口、排除膿液、抗炎消腫的目的。主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、雙鏈酶、α-淀粉酶、胰脫氧核糖核酸酶等。3）血凝和解凝類：都是從血液中提取出來的。凝血酶的作用：促使血中纖維蛋白原變成不溶性纖維蛋白,從而促使血液凝固，防止微血管出血。例如：蛇毒抗凝酶、促凝血酶原激酶。3）血凝和解凝類：纖維蛋白溶解酶的作用：使血塊溶解，為目前臨床上最新的一種酶制品,治療血栓靜脈炎、冠狀動脈栓塞等。例如:東菱克栓酶抑肽酶作為肽酶抑制劑：廣泛應(yīng)用于體外循環(huán)手術(shù)，大劑量抑肽酶可明顯減少心臟外科手術(shù)后的滲血，消除因心臟外科手術(shù)后滲血而導(dǎo)致的死亡。4）解毒類：主要作用是解除體內(nèi)或因注射某種藥物產(chǎn)生的有害物質(zhì)。主要品種有青霉素酶、過氧化氫酶和組織胺酶等。青霉素酶能夠分解青霉素分子（青霉噻唑）中的β一內(nèi)酰胺環(huán)，使變成青霉素銅酸，消除因注射青霉素引起的過敏反應(yīng)。

5）抗腫瘤的藥用酶：L-天冬酰胺酶是第一種用于治療白血病的酶；癌細胞缺乏天冬酰胺合成酶，自身生長時不能合成天冬氨酸，L-天冬酰胺酶可以切斷外來的天冬酰胺供給。20酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）

是一類常用的免疫酶技術(shù)，將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，用酶標記抗原或抗體，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行，檢測液體中未知抗體或抗原的方法。在ELISA方法中有三個必要的試劑：固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent）酶標記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”（conjugate）酶反應(yīng)的底物（顯色劑）酶底物顯色反應(yīng)測定波長辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色360,450

420ELISA的基本方法微孔板包被抗體加樣品(抗原)孵育洗滌加酶聯(lián)二抗(辣根過氧化物酶)孵育洗滌孵育加終止液(硫酸溶液)加底物(鄰苯二胺)顯色比色包被抗體的酶標反應(yīng)板加受檢標本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物加酶標抗體生成抗體-待測抗原-酶標記抗體的復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行抗原的定性或定量測定雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，先將已知抗體連接在固相載體上，待測抗原與抗體結(jié)合后再與酶標二抗結(jié)合，形成抗體-待測抗原-酶標二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測抗體原成正比。間接法

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。第二節(jié)酶的分離純化*第三節(jié)酶和細胞的固定化*第四節(jié)固定化酶和固定化細胞的反應(yīng)器*29第三節(jié)酶和細胞的固定化*一、固定化酶的制備1、固定化酶的定義:指限制或固定于特定空間位置的酶。具體講是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是純化的酶，也可以是結(jié)合在菌體（死細胞）或細胞碎片上的酶或酶系。302、固定化酶的特點（1）可以多次使用，酶的穩(wěn)定性提高；（2）反應(yīng)后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化。（3）反應(yīng)條件易于控制，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動控制；（4）酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。酶和細胞的固定化方法熱處理（細胞）物理吸附法共價結(jié)合法離子結(jié)合法載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法網(wǎng)格型微囊型3.酶的固定化方法與技術(shù)3233第五節(jié)固定化酶產(chǎn)品介紹(1)氨基?；福哼@是世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶，可以用于生產(chǎn)各種L-氨基酸藥物。1969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基?；?，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，將L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用來拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸經(jīng)過消旋化，生成DL-乙酰氨基酸．再進行拆分。生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的60％左右。固定化酶法生產(chǎn)L-氨基酸乙酰-DL－Ala

L－Ala+乙酰-D－AlaAminoacylase氨基酰化酶泵儲罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機消旋反應(yīng)器固定化酶柱子DEAE-葡聚糖－氨基?；妇wL-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala(2)青霉素?；福菏窃谒幬锷a(chǎn)中廣泛應(yīng)用的一種固定化酶?？捎枚喾N方法固定化。1973年已用于工業(yè)化生產(chǎn)，用于制造各種半合成青霉素和頭孢菌素。用同一種固定化青霉素?；?，只要改變pH等條件，就既可以催化青霉素或頭孢菌素水解生成6一氨基青霉烷酸(6一APA)或7一氨基頭孢霉烷酸(7一ACA)，也可以催化6一APA或7一ACA與其他的羧酸衍生物進行反應(yīng)，以合成新的具有不同側(cè)鏈基團的青霉素或頭孢霉素。藥物的酶法生產(chǎn)固定化細胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸（6-APA）

青霉素G（或青霉素V）經(jīng)青霉素?；缸饔?，水解除去側(cè)鏈后的產(chǎn)物稱為6-氨基青霉烷酸（6-APA），也稱無側(cè)鏈青霉素。6-APA是生產(chǎn)半合成青霉素的最基本原料。E.ColiD-816培養(yǎng)E.Coli

細胞液固定化細胞固定青霉素G（V）轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)化濾液6－APA過濾抽提作業(yè)：1、酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用？

2、酶聯(lián)免疫吸附法的原理和流程？391、細胞破碎2、酶的提取3、酶的分離方法4、酶的組合分離純化策略5、酶的濃縮、干燥與結(jié)晶第二節(jié)酶的分離純化*一、酶的分離純化技術(shù)路線細胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。41二、酶的提?。ㄒ唬┘毎扑樵S多酶存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破碎處理。1）機械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎機DY89-I型電動玻璃勻漿機421.采用緩沖體系：防PH大幅度變化而失活2.添加保護劑：防活性基團活性中心受影響3.抑制水解酶的作用：加酶抑制劑4.其他保護措施：溫度，PH，攪拌，光照，氧化等影響為了保護目的酶的生物活性，常采取下列保護措施：43（二）酶的抽提提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5M的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團的酶將酶從生物組織或細胞破碎液以溶解狀態(tài)最大限度釋放出來的過程。44(三）沉淀分離沉淀分離方法分離原理

鹽析沉淀法不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同，在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀等電點沉淀法兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出有機溶劑沉淀法酶與其它雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同，添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶粗提物：經(jīng)細胞破碎和抽提后，得到的含目的酶的無細胞抽提物。45（四）、酶的純化過濾與膜分離電泳離子交換層析46第三節(jié)酶和細胞的固定化*一、固定化酶的制備1、固定化酶的定義:指限制或固定于特定空間位置的酶。具體講是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是純化的酶，也可以是結(jié)合在菌體（死細胞）或細胞碎片上的酶或酶系。472、固定化酶的特點（1）可以多次使用，酶的穩(wěn)定性提高；（2）反應(yīng)后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化。（3）反應(yīng)條件易于控制，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動控制；（4）酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。酶和細胞的固定化方法熱處理（細胞）物理吸附法共價結(jié)合法離子結(jié)合法載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法網(wǎng)格型微囊型3.酶的固定化方法與技術(shù)4950（1）載體結(jié)合法：將酶結(jié)合于不溶性載體上的固定化方法。A.物理吸附法：用物理方法將酶吸附于不溶性載體上的固定化方法?；钚蕴?多孔玻璃,樹脂等優(yōu)點：操作簡單，可選用不同電荷和不同形狀的載體，有可能固定化和純化過程同時實現(xiàn)，酶失活后載體仍可再用。缺點：最適吸附酶量無規(guī)律可循，吸附量與酶活力不一定呈平行關(guān)系，酶與載體結(jié)合力不強，酶易于脫落，導(dǎo)致酶活下降并污染產(chǎn)物。51B、離子結(jié)合法：酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體上。DEAE-纖維素等優(yōu)點：操作簡單，處理條件溫和，酶的高級結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞。缺點：載體和酶的結(jié)合力弱，易受緩沖液種類或pH的影響，離子強度高時，酶易脫落。52C、共價結(jié)合法：酶以共價鍵結(jié)合于載體上。即將酶分子上非活性部位功能團與載體表面反應(yīng)基團進行共價結(jié)合的方法。優(yōu)點：酶與載體結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好，不易脫落。缺點：反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件劇烈，酶易失活和產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)。53（2）交聯(lián)法：用雙功能或多功能試劑使酶與酶或細胞與細胞之間交聯(lián)的方法。交聯(lián)法交聯(lián)酶法酶與輔助蛋白交聯(lián)法吸附交聯(lián)法載體交聯(lián)法常用的交聯(lián)劑：戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。54酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價偶聯(lián)酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶55（3）包埋法：A、網(wǎng)格型：將酶或細胞包埋在高分子凝膠細微網(wǎng)格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹脂。天然高分子化合物有淀粉、明膠、膠原、海藻膠、角叉菜膠，多用于固定化細胞。56B、微囊型：將酶或細胞包埋在高分子半透膜中。通常為直徑幾微米到幾百微米的球狀體。顆粒比網(wǎng)格型要小得多，比較有利于底物與產(chǎn)物的擴散，但反應(yīng)條件要求高，制備成本也高。5758新型的酶固定化方法溫和的條件下進行，減少酶活力損失，提高固定化效率光偶聯(lián)法：光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團的載體共價固定化酶無載體固定化酶：直接用交聯(lián)劑交聯(lián)用交聯(lián)劑交聯(lián)溶解酶、晶體酶、物理聚集酶、和噴霧干燥酶等四種無載體酶體系，。59無載體固定化酶優(yōu)點如下：1.催化活性高，成本低2.具備較高的催化劑比表面3.可加入多種酶4.底物擴散受限制少5.極端條件下穩(wěn)定性高二、固定化細胞的制備1、固定化細胞：將細胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細胞固定化技術(shù)。被限制或定位于特定空間位置的細胞稱為固定化細胞，它與固定化酶同被稱為固定化生物催化劑。固定化細胞主要利用細胞內(nèi)酶及酶系比固定化酶更普遍。如今該技術(shù)已擴展至動植物細胞，甚至線粒體、葉綠體及微粒體等細胞器的固定化。2、固定化細胞的特點為什么要固定化？——E顆粒小、難于截流或定位，而固定化細胞不僅兼具細胞特性、生物催化功能及固相催化劑特點。特點：①無需進行酶的分離純化；②細胞保持酶的原始狀態(tài)，故酶活回收率高；③細胞內(nèi)酶比固定化酶穩(wěn)定性更高；④細胞內(nèi)酶的輔因子可以自動再生；⑤細胞本身含多酶體系，可催化一系列反應(yīng)；⑥抗污染能力強。3、固定化細胞的制備技術(shù)固定化酶主要適用于細胞內(nèi)酶，底物和產(chǎn)物易于透過細胞膜，細胞內(nèi)不存在產(chǎn)物分解系統(tǒng)及其它副反應(yīng)。固定化細胞技術(shù)主要有載體結(jié)合法、包埋法、交聯(lián)法及無載體法。這些技術(shù)與前面提到的相關(guān)固定化酶的技術(shù)類似。63

三、固定化方法的選擇依據(jù)1.固定化方法的選擇（1）固定化酶應(yīng)用的安全性：要按照藥物和食品領(lǐng)域的檢驗標準作必要的檢查。所用試劑是否有毒性和殘留。盡可能選擇無毒性試劑。（2）固定化酶在操作中的穩(wěn)定性：在選擇固定化方法時要求固定化酶在操作過程中十分穩(wěn)定，能長期反復(fù)使用，在經(jīng)濟上有極強的競爭力。（3）固定化的成本：包括酶、載體、試劑的費用，也包括水、電、氣、設(shè)備和勞務(wù)投資等。642、載體的選擇一般是為了工業(yè)化生產(chǎn)，因此性能好、價格便宜是一項重要的指標。如聚乙烯醇、卡拉膠、海藻膠等。離子交換樹脂、金屬氧化物及不銹鋼碎屑等都是有應(yīng)用前途的載體。載體的選擇要考慮底物的性質(zhì)，如當?shù)孜餅榇蠓肿訒r，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不銹鋼屑或陶瓷材料制備固定化酶，以便實現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)和回收固定化酶。3.常用的固定化酶載體材料（自學(xué)）四、固定化酶（細胞）的性狀和性質(zhì)*

1、固定化酶的形狀（1）顆粒狀：包括酶珠、酶塊、酶片、酶粉。每種固定化方法均可制備顆粒狀，方法簡單，比表面積大，轉(zhuǎn)化效率高，適用各種反應(yīng)器。如酵母酶珠。（2）纖維狀：三醋酸纖維素用適當?shù)娜軇┤芙夂笈c酶混合，再用噴絲的方法就可制成酶纖維。比表面積大，轉(zhuǎn)化效率高，但只適用于填充床反應(yīng)器。此外，纖維酶可以織成酶布用于填充床反應(yīng)器。66（3）膜狀固定化酶：可通過共價結(jié)合的方法將酶偶聯(lián)在濾膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面積大，滲透阻力小，可用于酶電極，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、脲酶等酶膜。（4）管狀固定化酶：又稱酶管，利用管狀載體如尼龍、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，經(jīng)活化后與酶偶聯(lián)得酶管。酶管的機械強度大，切斷后可用于填充床反應(yīng)器，也可組裝成列管式反應(yīng)器。目前已制備出糖化酶、轉(zhuǎn)化酶、脲酶等酶管。2、固定化酶的性質(zhì)

（1）酶活力的變化：酶經(jīng)過固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸與載體發(fā)生結(jié)合，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或酶與底物結(jié)合時存在空間位阻效應(yīng)。包埋法中還有底物與產(chǎn)物擴散阻力增大。

（2）酶穩(wěn)定性的變化：包括對溫度、pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。固定化后，穩(wěn)定性提高，有效壽命延長。其原因是限制了酶分子之間的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶構(gòu)型的牢固程度。操作穩(wěn)定性；貯藏穩(wěn)定性；對蛋白酶的穩(wěn)定性。（3）酶學(xué)特性的變化

A、底物專一性：對底物的專一性下降。

B、最適pH：最適pH可能變大，也可能變小；pH-酶活曲線可能發(fā)生變化，其變化與酶蛋白和載體的帶電性質(zhì)有關(guān)。

C、最適溫度：一般升高。原因是固定化后空間結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。

D、最大反應(yīng)速度（Vm）：變化很小或不變。69五、評價固定化酶（細胞）的指標1.固定化酶活力測定活力回收率=固定化酶總活力/加入酶的總活力相對活力＝固定化酶總活力/（加入酶的總活力－上清液中未偶聯(lián)的酶活力）2.偶聯(lián)率及相對活力的測定第四節(jié)固定化酶和固定化細胞的反應(yīng)器用于酶進行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備稱為酶反應(yīng)器。酶催化反應(yīng)過程示意圖過程調(diào)控生物反應(yīng)器

消毒原料預(yù)處理

產(chǎn)物分離提純

產(chǎn)品生物催化劑制備空氣除菌能量熱量71常見的酶反應(yīng)器類型（了解）按結(jié)構(gòu)區(qū)分攪拌罐式反應(yīng)器（StirredTankReactor,STR）鼓泡式反應(yīng)器(bubblecolumnreactor,BCR)填充床式反應(yīng)器(packedcolumnreactor,PCR)流化床式反應(yīng)器(FluidizedBedReactor,FBR)膜反應(yīng)器(MembraneReactor,MR)按操作方式區(qū)分分批式反應(yīng)(batch)連續(xù)式反應(yīng)(continuous)流加分批式反應(yīng)(feedingbatch)混合形式連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器（ContinuousStirredTankReactor,CSTR）分批攪拌罐反應(yīng)器（BatchStirredTankReactor,BSTR）72一、反應(yīng)器的類型和特點1.間歇式攪拌罐反應(yīng)器用于游離酶反應(yīng)后隨即放料。又稱為批量反應(yīng)器。特點：底物與酶一次性投入反應(yīng)器內(nèi)，產(chǎn)物一次性取出；反應(yīng)完成之后，固定化酶（細胞）用過濾法或超濾法回收，再轉(zhuǎn)入下一批反應(yīng)。

優(yōu)點：裝置較簡單，造價較低缺點：固定化酶經(jīng)反復(fù)回收使用時，易失去活性，故在工業(yè)生產(chǎn)中，間歇式酶反應(yīng)器很少用于固定化酶，但常用于游離酶。74⒉連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器連續(xù)進料、連續(xù)出料連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器。向反應(yīng)器投入固定化酶和底物溶液，不斷攪拌，反應(yīng)達到平衡之后，再以恒定的流速連續(xù)流入底物溶液，同時，以相同流速輸出反應(yīng)液（含產(chǎn)物）。底物溶液進口

反應(yīng)液出口

優(yōu)點：混合良好，各部分組成相同，并與輸出成分一致。缺點：攪拌漿剪切力大，易打碎磨損固定化酶顆粒。3.鼓泡式反應(yīng)器用于游離酶和固定化酶的催化反應(yīng)。在使用鼓泡式反應(yīng)器進行固定化酶的催化反應(yīng)時，反應(yīng)系統(tǒng)中存在固、液、氣三相，又稱為三相流化床式反應(yīng)器。鼓泡式反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)簡單，操作容易,剪切力小，物質(zhì)與熱量的傳遞效率高，是有氣體參與的酶催化反應(yīng)中常用的一種反應(yīng)器。例如氧化酶催化反應(yīng)需要供給氧氣，羧化酶的催化反應(yīng)需要供給二氧化碳等。

4.噴射式反應(yīng)器