抗大鼠腎小球基底膜腎炎模型建立方法的改進

抗大鼠腎小球基底膜腎炎模型建立方法的改進【摘要】目的探討快速建立抗大鼠腎小球基底膜(glomerularbasementmembrane，GBM)腎炎動物模型的方法。方法30只正常SD大鼠隨機分為三組，腎炎模型A、B組和正常對照組。腎炎模型A、B組大鼠一次性尾靜脈注射兔抗GBM血清；正常對照組，尾靜脈注射等量正常兔血清。腎炎模型A組大鼠尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清前一周，通過足墊皮內(nèi)注射正常兔血清進行預免疫。上述三組大鼠于尾靜脈注射兔血清后第2、7、14和21天，檢測24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮含量；第21天處死大鼠取腎組織觀察腎小球和腎小管的病理變化。結果腎炎模型A、B組，尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清后，24h尿蛋白，血肌酐和血尿素氮含量均明顯升高(P＜)，A組升高程度均較B組明顯(P＜)。光鏡檢測A組新月體形成率較B組明顯升高，腎小管內(nèi)蛋白管型較B組多，部分腎小球不完全纖維化，B組腎小球未見纖維化。對照組上述指標均無明顯變化。結論大鼠注射兔抗GBM血清之前，進行正常兔血清預免疫，可以更快誘導大鼠產(chǎn)生抗GBM腎炎。

【關鍵詞】抗GBM腎炎模型方法大鼠

【Abstract】ObjectiveToapproachthefastmethodtoestablishratmodelsofanti-GBM30normalratswererandomlydividedintonephritisgroupA,nephritisgroupBandcontrolgroup.Theratsinnephritisgroupswereinjectedofrabbitanti-ratGBMserum.TheratsinnephritisgroupAwerepreimmunizedsubcutaneofnormalrabbitserum7daysbeforetheinjectionofrabbitanti-ratGBMserum.Allratswereobservedfor24hurinaryprotein,serumcreatine,serumureaonthe2ndday,the7thday,the14thdayandthe21stday.Allratswerekilledonthe21stdayandthekidneyspecimenswerecollectedforhistologicanalysis.ResultsThe24hurinaryprotein,serumcreatineandserumureawereobviouslyincreasedintheratsinjectedwithrabbitanti-GBMserum(P＜),especiallyinnephritisgroupA(P＜).ThereweremorecrescentsandproteincastsinnephritisgroupAthangroupBandpartoftheglomerulewaspartialfibrousdegenerationinnephritisgroupA.TherewasnofibrosisobservedinnephritisgroupAandnomarkedchangesatalltheabovetimepointsincontrolgroup.ConclusionsTheratscanbefastinducedtotheanti-GBMnephritisbypreimmunizingwithnormalrabbitserumbeforeinjectingtherabbitanti-ratGBMserum.

【Keywords】Anti-GBMnephritis;model;method;rat

新月體性腎炎是人類腎小球腎炎中常見病、多發(fā)病。臨床上多數(shù)患者起病急、病情兇險、病程迅速、預后較差。該病是一種自身免疫性疾病，其病理特征為大部分腎小球內(nèi)形成新月體，早期為細胞型新月體，隨著炎癥發(fā)展，細胞型新月體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維性新月體，最終可導致整個腎小球纖維化，腎功能喪失。

大鼠抗GBM腎炎是利用異種抗大鼠GBM抗體直接誘導發(fā)生的具有典型的人類新月體性腎炎病理變化的動物模型。單純注射抗GBM血清誘導的大鼠抗GBM腎炎，病程發(fā)展較慢，形成典型的新月體性腎炎需時較長。本實驗在原來的實驗基礎上有所改變，先對大鼠足底注射正常兔血清進行預免疫，1周后再注射兔抗大鼠GBM血清，建立大鼠抗GBM腎炎模型，探討一種快速建立典型的新月體性腎炎動物模型的方法，以期為進一步研究人類新月體性腎炎提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

動物正常健康SD大鼠，190～210g，徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

主要試劑兔抗大鼠GBM血清，本實驗室制備，膠原酶、完全福氏佐劑購自上海華美生物工程有限公司。

大鼠抗GBM腎炎模型的復制及動物分組處理正常SD大鼠30只，雌雄不限，180～220g，實驗前在本實驗室飼養(yǎng)4天，以適應環(huán)境。在此期間單籠收集大鼠24h尿，測24h尿蛋白含量，心臟穿刺采血收集血清測血肌酐和尿素氮含量，30只大鼠的上述指標均無異常。大鼠隨機分為三組，腎炎模型A組、腎炎模型B組及正常對照組，每組10只。腎炎模型A、B組大鼠一次性尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清；正常對照組大鼠尾靜脈注射等量正常兔血清，劑量均為1ml/100g。腎炎模型A組大鼠尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清前1周，足墊皮內(nèi)注射兔正常血清進行預免疫，正常兔血清與完全福氏佐劑等量混合，總體積為。

主要觀察指標

生化指標于尾靜脈注射兔血清后第2、7、14天和第21天，收集24h尿，采用改良Lowry法測24h尿蛋白含量；心臟采血收集血清，采用苦味酸法測血肌酐含量，二乙酰一肟法測血尿素氮含量。

病理學檢查于尾靜脈注射兔血清后第21天，處死大鼠取腎組織進行光鏡及電鏡檢查。腎組織切片經(jīng)H-E染色，光鏡觀察腎小球體積大小、腎小球內(nèi)細胞數(shù)及腎小管內(nèi)蛋白管型等情況，腎小球尿囊腔內(nèi)可見三層細胞為形成新月體，計數(shù)50個腎小球，統(tǒng)計新月體形成率。電鏡觀察腎小球基底膜變化、腎小球內(nèi)電子致密物沉積、足突融合等情況。

統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用t檢驗，為統(tǒng)計學差異有顯著性。

2結果

24h尿蛋白含量的變化腎炎模型A、B組大鼠，尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清后，各時間點24h尿蛋白含量均較正常對照組明顯升高(P＜)，A組第2、7天和14天尿蛋白含量較B組明顯升高(P＜)，A組于第21天尿蛋白含量有下降趨勢。注射正常兔血清后，正常對照組大鼠24h尿蛋白含量無明顯改變，見表1。表1大鼠注射兔血清后各時間點24h尿蛋白含量注:與正常對照組相比**;A組與B組相比ΔΔ

血肌酐含量的變化尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清后，腎炎模型A組大鼠第7、14天和21天血肌酐含量較正常對照組明顯升高(P＜)，腎炎模型B組大鼠第14天和第21天血肌酐含量較正常對照組明顯升高(P＜)。腎炎模型A組大鼠第14天和第21天血肌酐含量較B組明顯升高(P＜)。N組大鼠血肌酐含量無明顯改變，見表2。表2大鼠注射兔血清后各時間點血肌酐含量注:與正常對照組相比*;與正常對照組相比**;A組與B組相比Δ;A組與B組相比ΔΔ

血尿素氮含量的變化尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清后，腎炎模型A組大鼠第7、14天和21天血尿素氮含量較N組明顯升高(P＜)，腎炎模型B組大鼠第21天血尿素氮含量較N組明顯升高(P＜)。腎炎模型A組大鼠第14天和第21天血尿素氮含量較B組明顯升高(P＜)。N組大鼠血尿素氮含量無明顯改變，見表3。表3大鼠注射兔血清后各時間點血尿素氮含量注:與正常對照組相比*;與正常對照組相比**;A組與B組相比Δ;A組與B組相比ΔΔ

病理檢查尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清后第21天，腎炎模型A組大鼠新月體形成率為45%，部分腎小球尿囊腔完全閉塞，少數(shù)腎小球不完全纖維化，腎小管內(nèi)可見大量蛋白管型(見圖1、2)。腎炎模型B組大鼠新月體形成率為13%，腎小管內(nèi)蛋白管型較A組少，腎小球未見纖維化(見圖3)。電鏡觀察腎炎模型A組腎小球基底膜明顯增厚，內(nèi)皮下大量電子致密物沉積，足突大片融合(見圖5)。腎炎模型B組腎小球基底膜增厚不明顯，內(nèi)皮下可見少量電子致密物沉積，足突局部融合(見圖6)。對照組大鼠腎組織無明顯變化(見圖4、7)。

3討論

人類新月體性腎炎是一種自身免疫性疾病，發(fā)病機制較為復雜，其病理特征為大部分腎小球伴有新月體形成，早期的新月體主要由浸潤的巨噬細胞和增生的腎小球囊上皮細胞組成，隨著炎癥的發(fā)展，細胞型新月體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維型新月體，最終導致整個腎小球纖維化，腎功能喪失。

大鼠抗GBM腎炎通過注射異種抗大鼠GBM抗體誘導產(chǎn)生，其病變?nèi)缂毎錾?、炎癥細胞的浸潤、纖維蛋白的滲出及新月體的形成、GBM不規(guī)則增厚和斷裂等病理變化均與人類新月體性腎炎相似。該模型具有重復性好和制作容易等特點，在研究新月體性腎炎的發(fā)病機制及探討疾病的防治措施等方面，一直被廣泛采用。但是單純注射抗GBM血清誘導的大鼠抗GBM腎炎，病程發(fā)展較慢，形成病變典型的新月體性腎炎需時較長。在本實驗中，腎炎模型A組大鼠在注射兔抗大鼠GBM抗體之前，先通過足底皮內(nèi)注射正常兔血清進行預免疫，腎炎模型B組大鼠僅注射兔抗大鼠GBM抗體，實驗結果顯示腎炎模型A組24h尿蛋白含量、血肌酐及血尿素氮含量升高均較B組出現(xiàn)早，且升高程度較B組明顯，腎炎模型A組24h尿蛋白含量在第21天有下降趨勢，其原因可能是隨著炎癥細胞浸潤并活化及纖維蛋白等炎性因子的參與，促使腎小球纖維化進行性加重，尿囊腔壓力增大，在一定程度上阻止了蛋白的外漏，另一方面大量蛋白管型使腎小管堵塞，大量蛋白淤積于腎小球內(nèi)，加劇腎小球纖維化，腎功能急劇下降。病理結果顯示腎炎A組大鼠新月體形成率較B組明顯高，而且病理變化更典型。這些結果說明腎炎A組較B組腎炎癥狀出現(xiàn)早，病程發(fā)展快，這和臨床上新月體性腎炎的急性進行性特征更為一致。

大鼠抗GBM腎炎有兩個免疫時相，即異體免疫時相和自體免疫時相［1］。異體免疫時相是指兔抗大鼠GBM抗體注射到大鼠體內(nèi)后，兔抗GBM抗體迅速固定于大鼠GBM上，通過激活補體及其他一系列途徑［2～5］，損傷大鼠的GBM，此時相持續(xù)7～10天。自體免疫時相包括兩個方面：一方面是指大鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗兔免疫球蛋白的抗體，并與沉積在GBM上的兔免疫球蛋白結合，導致沉積的IC繼續(xù)擴大，加重腎組織的病理損害［6］；另一方面因大鼠腎組織損傷而導致自身隱蔽抗原的釋放，如GBM等，從而誘導自身免疫細胞損傷GBM［7～8］，大鼠GBM損傷，導致蛋白尿，炎性細胞浸潤，新月體形成等。在腎臟病理損傷中，自體免疫發(fā)揮主要作用。

通過皮內(nèi)注射正常兔血清，經(jīng)過一段時間，大鼠體內(nèi)可以產(chǎn)生針對兔免疫球蛋白的抗體及致敏淋巴細胞。當兔抗大鼠GBM血清注射到大鼠體內(nèi)時，兔抗大鼠GBM抗體與GBM結合后，大鼠體內(nèi)的針對兔免疫球蛋白的抗體及反應性T細胞可以在很短時間內(nèi)與結合在大鼠GBM上的兔抗GBM抗體發(fā)生免疫反應，同時引起GBM的損傷,此損傷更快速且更嚴重。在腎炎模型B組中自體免疫時相發(fā)生在異體免疫時相之后，只有在大鼠產(chǎn)生抗兔血清的抗體后，或是自身GBM受損暴露后才會發(fā)生自體免疫應答。腎炎模型A組通過預免疫，提前使大鼠體內(nèi)生成兔免疫球蛋白的抗體及致敏淋巴細胞，自體免疫時相較腎炎模型B組發(fā)生較早，相應引起的免疫損傷也較嚴重，因此腎炎癥狀出現(xiàn)更早，能在較短時間內(nèi)誘導大鼠產(chǎn)生典型新月體性腎炎病理改變。

本實驗通過預免疫，在較短時間內(nèi)誘導大鼠產(chǎn)生典型的新月體性腎炎動物模型，以期為進一步研究人類新月體性腎炎提供實驗依據(jù)。

【參考文獻】

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