總RNA的提取電泳鑒定及RTPCR

實驗內容1、小鼠肝臟組織總RNA的提取2、RNA的瓊脂糖凝膠電泳3、以RNA為模板進行RT-PCR4、PCR產物的電泳及回收本文檔共28頁；當前第1頁；編輯于星期三\7點39分實驗一.提取小鼠肝臟組織的RNA本文檔共28頁；當前第2頁；編輯于星期三\7點39分一、真核細胞的總RNA1、mRNA:1-5%5`鳥嘌呤7位甲基化—CH3修飾。

1）免受核酸酶破壞，

2）起始、促進蛋白質合成。

3`poly(A)尾巴結構20--200個A.翻譯所必需。起始密碼：AUG

終止密碼：UAA,UAG,UGA。

2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%

大亞基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt

小亞基40S:18S=1874nt本文檔共28頁；當前第3頁；編輯于星期三\7點39分二、RNA提取的注意事項

RNA酶：廣泛存在：灰塵、人體唾液、實驗器材表面。生物活性非常穩(wěn)定：耐熱、耐酸、耐堿。

1、盡量避免外源性RNase污染

A.操作環(huán)境空氣潔凈。帶手套、口罩。

B.用新開封的化學試劑。（試劑應該專用）

C.

一次性塑料器材最好是新開封，

(DEPC水處理后）高壓滅菌。

D.玻璃器材、水都應該經過去RNase處理。對玻璃器材還應該進行高溫烘烤。

2、抑制內源性RNase活性：RNase抑制劑。

RNA分離的關鍵因素：避免RNA酶的污染。本文檔共28頁；當前第4頁；編輯于星期三\7點39分1)發(fā)放口罩，帽子，每個組來一個人領取。

將1mLTrizol試劑移入Eppendorf管中。2)實驗教師操作:

取新鮮小鼠肝臟組織，組織塊不宜過大,

放在玻片上立即研磨,研磨要徹底。3)將研磨后的組織(小米粒大小)轉移至1mLTrizol試劑中，蓋緊蓋，上下顛倒混合2min以上。

使組織細胞充分裂解。肉眼觀察可見液體變成均勻渾濁狀。4)室溫孵育10min。三、RNA提取的實驗操作

播放有聲課件1:RNA提取方法及注意事項本文檔共28頁；當前第5頁；編輯于星期三\7點39分1、異硫氰酸胍法：

GuSCN是一種強的蛋白質變性劑，能夠裂解細胞的同時，還能有效地抑制內源性Rnase的活性，通過有機溶劑的分步抽提，可獲得純度較高的細胞總RNA。特點：需低溫操作，但價格經濟。2、Trizol試劑（商品化產品）特點：在室溫下可以提取細胞總RNA，簡單、快速、提取量大、純度高。3、mRNA提取試劑盒真核細胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚dT纖維素結合mRNA，將其從細胞總RNA中分離出來。RNA提取的幾種方法室溫孵育10min介紹本文檔共28頁；當前第6頁；編輯于星期三\7點39分RNase抑制劑1、DEPC(二乙基焦炭酸鹽)

最常用的RNase抑制劑:與蛋白質中的組氨酸結合，使蛋白質變性。

有效濃度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室溫磁力攪拌20分鐘。用于浸泡各種器材。滅活條件：高壓。在Tris溶液中半衰期為1.25min。試劑的配制:無RNase的溶液(用DEPC水配制,高壓)

儲存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4C，或液氮中。2、肝素：使用濃度：0.1—10mg/ml

效果:37C時，可抑制95%的RNase活力。如果與DEPC聯(lián)合應用，具有極強的抑制效果。本文檔共28頁；當前第7頁；編輯于星期三\7點39分5)加入200l氯仿，震蕩混勻20-30s，室溫放置5min（此期間液體開始分層，不要輕易攪動液體）。6)10000rpm，離心5minRNA(清澈透明)DNAProtein7)將清澈透明的上層水相轉移至另一離心管中。有聲課件2:RNA干燥及溶解技巧本文檔共28頁；當前第8頁；編輯于星期三\7點39分8)沉淀RNA：加0.5ml異丙醇，上下顛倒混勻，室溫10min。

10,000rpm，4C，離心10min．棄上清。９)加1ml75%乙醇洗滌管壁。

(注意貼管壁在沉淀的對側緩慢加入，不要攪動沉淀)10)7500rpm，4C離心1min，棄上清．再離心幾秒鐘，將管壁液體（用加樣器）完全移凈。用TriZol試劑提取總RNA時，全程均在室溫進行。當RNA沉淀用水溶解后，應該注意在冰上操作，操作要迅速。本文檔共28頁；當前第9頁；編輯于星期三\7點39分11)室溫干燥3－5min

（根據RNA沉淀大小決定，干燥后的沉淀應該是無色膠樣透明狀，避免過分干燥,此步驟非常關鍵。）注意事項：RNA:避免放在37C孵箱中過度干燥以防無法溶解。

RNA沉淀必須絕對干燥，微量乙醇殘留，容易造成RT的失敗，但過分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因。判斷RNA沉淀是否充分干燥但又不是過分干燥是逆轉錄成功的關鍵環(huán)節(jié)。RNApellet：透明膠樣干燥后應該無色透明本文檔共28頁；當前第10頁；編輯于星期三\7點39分12）RNA的溶解：用加樣器吸取冰冷DEPC-H2O13.5l，加到RNA上，進行吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA應置冰上保存。13)吸出4.5l溶液放到冰上備用(將用于電泳).14)剩余9l溶液,放到冰上備用（將用于RT－PCR）.注意：

RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加樣器反復多次吹打方可。但由于溶液體積非常小，要避免出現(xiàn)氣泡影響RNA的溶解。避免氣泡的方法：用加樣器的第一擋每次吹打都不要打出氣體判斷溶解程度：吹打時液體流動不拐彎為止。本文檔共28頁；當前第11頁；編輯于星期三\7點39分實驗二.RNA的瓊脂糖凝膠電泳本文檔共28頁；當前第12頁；編輯于星期三\7點39分

基本過程同DNA電泳一樣，但應明確一點的是，因為RNA分子對RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解RNA的瓊脂糖凝膠電泳本文檔共28頁；當前第13頁；編輯于星期三\7點39分

RNA樣品：4.5l

上樣緩沖液：1l

混勻后，5.5l直接電泳上樣（100伏，10－30分鐘）上樣前預電泳5min。

注意:電泳槽的清潔！所有試劑、器材、溶液需要滅RNA酶處理。

瓊脂糖凝膠要新鮮配制！紫外透射儀觀察電泳結果RNA的電泳上樣：本文檔共28頁；當前第14頁；編輯于星期三\7點39分RNA電泳結果rRNA可以作為內部Marker分子，通過觀察rRNA的兩條帶（28S和18S）的比例，可以判斷所提取mRNA是否存在降解。

RNA電泳并不能判斷mRNA是否提取成功，也不作為鑒定RNA提取質量的常規(guī)方法，因為在電泳過程中RNA可能發(fā)生降解。本文檔共28頁；當前第15頁；編輯于星期三\7點39分

分析本次實驗結果：28S、18S和5S的比例。RNA電泳結果分析本文檔共28頁；當前第16頁；編輯于星期三\7點39分實驗三：逆轉錄反應及PCR（RT-PCR)本文檔共28頁；當前第17頁；編輯于星期三\7點39分逆轉錄酶：存在于逆轉錄病毒體內。常見有哺乳動物型37oC，禽類型42oC。以mRNA為模板的DNA聚合酶，形成與RNA堿基相互補DNA鏈，后者稱為互補DNA－cDNA。

RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA雜合鏈上的RNA。逆轉錄反應原理AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC,annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC,RTasemRNAmRNAcDNA10min1-2h

逆轉錄有聲課件3:RT的原理和注意事項本文檔共28頁；當前第18頁；編輯于星期三\7點39分總RNA9lOligodT(0.05g/ml)1l(終：2.5ng/ml)

輕彈管底混合，置65℃水浴10min，

立即冰浴2min（防止RNA形成二級結構）。第一步：打開RNA鏈之間的二級結構，使OligodT特異性地結合到PolyA尾。本文檔共28頁；當前第19頁；編輯于星期三\7點39分

5RT-buffer4lRNasin(RNA酶抑制劑，40U/ml)1ldNTPs(10mmol/L)4lAMV（逆轉錄酶）1l輕彈管底混合。置42oC水浴1h。第二步：向上述反應溶液中依次加入下列試劑第三步：將上述反應移至68oC水浴10min以滅活RTase，并冰浴，保存?zhèn)溆帽疚臋n共28頁；當前第20頁；編輯于星期三\7點39分午休本文檔共28頁；當前第21頁；編輯于星期三\7點39分—PCR反應體系的建立—PCR反應的進行—PCR產物的電泳—結果觀察與分析—PCR產物回收實驗操作內容

有聲課件（1）：

PCR的基本原理及反應體系的組成PCR反應動畫目的基因片斷的體外擴增（2）：PCR反應條件的確定及PCR常見問題的解決方案本文檔共28頁；當前第22頁；編輯于星期三\7點39分1）模板DNA(上次課逆轉錄的cDNA）4l2）加入下列試劑,，順序可以改變

10XPCRbuffer(含MgCl2)5ldNTPs(10mM)1l3’引物(10mol/L)1l5’引物(10mol/L)1l3）加去離子水，補足50l最終反應體系4）TaqDNA聚合酶(2U/l)1l實驗操作一、建立PCR反應體系3.輕彈管底混勻，然后放入離心機的套管內，用離心機甩一下；4.將PCR小管交給老師，老師統(tǒng)一將樣品放入PCR儀。取1支200l微量離心管（在第一組同學的實驗臺上方的平皿里）中，用Marker筆在管的側面標記；2.依次加入下列試劑：本文檔共28頁；當前第23頁；編輯于星期三\7點39分注意：（1）PCR相關試劑均放在每排實驗臺上方中間位置處的藍色圓盒中

（2）加樣的體積要準確，1

l的體積不應該超過白色槍頭的第一個格。

本文檔共28頁；當前第24頁；編輯于星期三\7點39分實驗操作二、PCR反應的進行1、將樣品放入PCR儀中2.PCR反應條件

94℃

30SDNA變性(Denaturation)55℃30S退火(Annealing)72℃45S延伸(Extension)

上述溫度變化進行30個循環(huán)(cycles)。

72