ES細胞源性表皮干細胞與類真皮構(gòu)成皮膚類似物的分化

ES細胞源性表皮干細胞與類真皮構(gòu)成皮膚類似物的分化【摘要】【目的】以ES細胞源性表皮干細胞為種子細胞構(gòu)建皮膚類似物，探討其在皮下的分化潛能?！痉椒ā縃oechst33342標記E14-ES細胞，經(jīng)羊膜誘導4d后，形成表皮干細胞克隆，并以其作為種子細胞，取129胎鼠成纖維細胞與復合凝膠－明膠海綿復合，形成皮膚類似物，埋植于129小鼠皮下組織。術(shù)后2周、4周、6周、8周取材，做HE染色觀察，β1整合素、CK15、CK19、CEA、CK18免疫組化熒光雙標和免疫組化觀察?！窘Y(jié)果】術(shù)后2周和4周，植塊內(nèi)可見單層立方或柱狀上皮構(gòu)成的管狀和泡狀結(jié)構(gòu)，6周和8周后，可見角化復層上皮、毛囊樣、汗腺樣、皮脂腺樣等結(jié)構(gòu)，免疫雙標結(jié)果顯示，植入2周和4周，帶有藍色核標記的細胞形成的管狀或泡狀結(jié)構(gòu)呈β1整合素、CK15、CK19、CEA和CK18陽性，6周和8周后，HE染色中汗腺樣結(jié)構(gòu)呈CEA、CK18陽性。【結(jié)論】ES細胞源性表皮干細胞與類真皮構(gòu)建的皮膚類似物，在同種小鼠皮下有分為角化復層上皮、汗腺樣、毛囊樣、皮脂腺樣等結(jié)構(gòu)的潛能。

【關(guān)鍵詞】ES細胞；表皮干細胞；皮膚附屬結(jié)構(gòu)；定向分化；羊膜

Abstract：【Objective】ToexplorethedifferentiationpotencyofskinanalogreconstructedwithEScell-derivedepidermalstemcellsanddermalanaloginhypodermis.【Methods】E14-EScells,labeledwithHoechst33342,werecoculturedwithhumanamnion.Fourdayslater,epidermalstemcellcloneswereformed.TheskinanalogwasreconstructedwithES-derivedepidermalstemcellsanddermalanalog,whichreconstructedwith129micefetusfibroblastsandcompoundgel-gelatinsponge.Theskinanalogsweretransplantedinto129micehypodermis.Thedifferentiationtissuesofskinanalogweresampledat2w,4w,6w,and8w.SectionswereobservedwithHEstaining,immunohistochemicalanddi-labeledimmunofluorescencemethodstotesttheexpressionofβ1integrin,CK15,CK19,CEA,andCK18.【Results】Sectionsshowedtubularorfollicularlikestructureformedwithsimpleorstratifiedepitheliumat2and4weeks.Keratinizedstratifiedsquamousepithelium,sweatgland-like,sebaceousgland-likeandhairfollicle-likestructureswereobservedat6weekand8weekaftertransplantation.CellslabeledbyHoechst33342,formedtubularorfollicular-likestructure,expressedβ1integrin,CK15,CK19,CEAandCK18positiverespectivelyat2wand4w.Thesweatglands-likestructureexpressedCEAandCK18positiverespectivelyat6wand8w.【Conclusion】SkinanalogsreconstructedwithES-derivedepidermalstemcellsanddermalanalogscandifferentiateintokeratinizedstratifiedsquamousepithelium,sweatgland-like,sebaceousgland-likeandhairfollicle-likestructuresinhypodermis.

Keywords:EScells；epidermalstemcells；skinappendages；committeddifferentiation；amnion

目前組織工程皮膚的種子細胞多采用角質(zhì)形成細胞，它只能形成表皮，不能形成皮膚附屬結(jié)構(gòu)。我們先前的研究表明，胚胎干細胞細胞經(jīng)人羊膜誘導后，分化為ES細胞源性表皮干細胞，將其植入裸鼠皮下、腹腔及小鼠腎被囊內(nèi)均具有分化角化復層上皮、毛囊樣、皮脂腺樣和汗腺樣結(jié)構(gòu)的潛能，表明ES細胞源性表皮干細胞具有相當穩(wěn)定的分化潛能［1－4］，因此以ES細胞源性表皮干細胞作為組織工程皮膚的種子細胞具有重要的研究和應用價值。在胚胎發(fā)育的過程中，真皮對表皮及其附屬物的發(fā)生、分化具有重要作用，真皮中的細胞主要是成纖維細胞，具有分泌細胞外基質(zhì)和多種生物活性因子的功能，我們用成纖維細胞和明膠海綿與復合凝膠組成類真皮，觀察其在皮下對ES細胞源性表皮干細胞分化的影響，為進一步構(gòu)建具有皮膚附屬結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚打下基礎。

1材料和方法

材料

細胞和所用材料129小鼠E14胚胎干細胞由中山大學附二院黃紹良教授提供。人羊膜采自中山大學附一院產(chǎn)房足月妊娠剖腹產(chǎn)的胎膜。Hoechst33342；成纖維細胞培養(yǎng)基；ES細胞源性表皮干細胞維持培養(yǎng)基。

實驗動物孕齡～d昆明小鼠；清潔級129小鼠，約20～25g，清潔級SD大鼠，約100g，均雌雄不拘，購自中山大學北校區(qū)實驗動物中心。

免疫組化試劑Ⅰ抗：小鼠抗人β1整合素單抗，小鼠抗人CK19單抗、兔抗人癌胚抗原多抗、小鼠抗人CK18、小鼠抗人CK15單抗、Ⅱ抗及Avidin結(jié)合的SABC-Cy3試劑盒均購自博士德試劑公司。

真皮材料明膠海綿：由南京金陵制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格：6cm×2cm×cm，批號：021211。剪成1cm×1cm×cm大小，孔徑大小約為300～550μm。

自制復合凝膠將鼠尾膠原、甲殼糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素紫外燈照射下，用mol/L的乙酸攪拌融解2～3h，冰浴條件下加入mL10×DMEM培養(yǎng)基，NaOH調(diào)pH為，終體積為4mL，4℃儲存?zhèn)溆?。鼠尾膠原購自廣州紅十字會醫(yī)院，脫已酰甲殼糖、透明質(zhì)酸、6-硫酸軟骨素均為SIGMA公司產(chǎn)品。

方法

人羊膜的制備及ES細胞源性表皮干細胞的體外誘導分化見參考文獻［5］。

ES細胞的核標記選擇生長良好的對數(shù)生長期ES細胞，將培養(yǎng)液換成標記培養(yǎng)液，置體積分數(shù)5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)箱1～3h，吸棄標記培養(yǎng)液，PBS洗3次，換ES細胞完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

129胎鼠皮膚成纖維細胞的培養(yǎng)孕齡17d至出生前的129孕小鼠，處死后，無菌條件下取出胚胎，去除胚胎頭、四肢和內(nèi)臟，剪碎軀干部分組織，加入g/L胰蛋白酶消化1min，用含血清的培養(yǎng)基中止消化，離心，棄上清，用培養(yǎng)基重新懸浮組織，將組織接種入25cm2培養(yǎng)瓶，體積分數(shù)5％CO237℃靜置培養(yǎng)，4～6d原代細胞長滿，消化傳代，3～5代細胞用于實驗。

皮膚類似物的構(gòu)建將誘導后的ES細胞源性表皮干細胞和成纖維細胞均按1×105個/mL與復合凝膠混勻，滴加入明膠海綿，每塊復合物體積約1cm×1cm×cm。

皮下移植實驗129小鼠用40g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺上，剃去背部毛，消毒后，沿背部正中線兩側(cè)距脊柱1cm切開皮膚，分離皮下組織，暴露肌層，將構(gòu)建的皮膚類似物埋入皮下，每只動物埋兩塊，縫合皮膚，動物蘇醒后飼養(yǎng)，共8只動物。

組織學檢查術(shù)后2、4、6、8周取材，每次取2只動物，4塊組織，用40g/L多聚甲醛固定6～8h，所得標本一半常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片6μm，HE染色；另一半標本300g/L蔗糖過夜，冰凍切片，免疫組化染色，免疫組化染色按SABC-Cy3法，行β1整合素、CK19、CK15、CEA和CK18抗體免疫組織化學顯色，β1整合素濃度為1∶30，余Ⅰ抗?jié)舛染鶠?∶100；Ⅱ抗?jié)舛葹?∶100，SABC-Cy3熒光顯色。

2結(jié)果

體外培養(yǎng)細胞的觀察

Hoechst33342標記ES細胞1～3h后，于熒光倒置顯微鏡下可見細胞核被標記為藍色的細胞克隆，人羊膜上誘導4～5d后，仍可見生長在羊膜表面的細胞克隆呈藍色核標記。培養(yǎng)的胎鼠皮膚成纖維細胞生長旺盛，細胞飽滿。

大體觀察

術(shù)后2周時，皮下埋植物體積較植入時無顯著變化，呈白色，有結(jié)締組織包繞，4周后增生的組織塊體積增大明顯，6周增大達高峰。

HE染色

2周時植入的類真皮材料已降解吸收，2～4周多見單層立方或柱狀上皮圍成的管狀和泡狀結(jié)構(gòu)，少見復層上皮圍成的管腔樣結(jié)構(gòu)，上皮細胞排列緊密，核染色情況及核與胞漿的比例與正常細胞相似，未見異常增生。6～8周植塊中，除上述結(jié)構(gòu)外，還可見復層角化上皮和角化珠、汗腺樣、毛囊樣、皮脂腺樣等結(jié)構(gòu)，與正常小鼠皮下組織的結(jié)構(gòu)有明顯不同。

2．4免疫組化和免疫熒光雙標

2周組織塊中，可見單層或復層管狀或泡狀結(jié)構(gòu)分別呈核熒光和β1整合素、CK15、CK19雙標陽性，6周后核熒光衰減，但HE染色中汗腺樣結(jié)構(gòu)呈CEA和CK18陽性。

3討論

我們以往的研究［1-5］表明，利用人羊膜與胚胎干細胞共培養(yǎng)，可將其定向誘導為表皮干細胞，表皮干細胞在裸鼠皮下、腹腔及同種129小鼠腎被囊內(nèi)具有相同的分化時程，即在4周前主要分化為單層立方或柱狀上皮構(gòu)成的管狀和泡狀結(jié)構(gòu)，4周后才分化發(fā)育為角化復層上皮、汗腺樣、毛囊樣和皮脂腺樣等結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果強烈提示外環(huán)境的改變對ES細胞源性表皮干細胞的固有分化發(fā)育過程影響不大，ES細胞源性表皮干細胞作為組織工程皮膚的種子細胞具有重要的研究應用價值。皮膚由表皮和真皮構(gòu)成，表皮來源于體表外胚層，而真皮由中胚層間充質(zhì)分化形成，至于其后發(fā)育形成的皮膚附屬結(jié)構(gòu)，如汗腺、毛囊和皮脂腺等，都是由表皮的生發(fā)層向深層真皮生長、分化而形成的，可見在皮膚及其附屬結(jié)構(gòu)的發(fā)育形成過程中，真皮間充質(zhì)及其中的成纖維細胞有著重要作用，在真皮替代物中引入成纖維細胞對于組織工程皮膚的構(gòu)建具有重要意義［6,7］,在真皮支架中加入成纖維細胞使真皮層具有細胞活性，更加接近生理狀態(tài)，并能以活體形式對移植環(huán)境作出反應；使真皮基質(zhì)結(jié)構(gòu)在成纖維細胞的作用下有序化；通過成纖維細胞的分泌補充真皮替代物中缺失的細胞因子和對真皮替代物作表面修飾，提高真皮替代物誘導創(chuàng)周血管內(nèi)皮細胞向其內(nèi)移行的能力，加速血管化速度,提高其促進表皮細胞的生長、分化和基底膜形成的能力。

我們所構(gòu)成的皮膚類似物中包含有膠原、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、甲殼素等，其中膠原、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸是正常細胞外基質(zhì)的成分，純膠原在體內(nèi)被酶解的時間很短，加入甲殼糖后降解速度下降，這是因為分子間發(fā)生交聯(lián)作用，甲殼糖和膠原復合后，可以限制膠原酶對膠原的識別以及減少膠原酶的直接接觸［8］，透明質(zhì)酸有利于細胞的吸附、生長、增殖【9】，硫酸糖胺多糖有助于皮膚附屬結(jié)構(gòu)的發(fā)生［10］，同時我們在真皮支架中引入了成纖維細胞，將復合物埋植在129小鼠皮下，可見ES細胞源性表皮干細胞分化角化復層上皮、汗腺樣、毛囊樣、皮脂腺樣結(jié)構(gòu)。有研究表明成纖維細胞產(chǎn)生的基質(zhì)和各種細胞因子或生長因子，包括Ⅰ、Ⅲ型膠原及纖粘連蛋白、層粘連蛋白、FGF、VEGF等，對真皮的重建，種子細胞的生長、發(fā)育、分化、血管長入及基膜的形成等方面都可能產(chǎn)生重要作用。本研究為將來構(gòu)建具有生理功能的人工皮膚奠定了重要的實驗基礎。

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