構(gòu)建質(zhì)粒 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建質(zhì)粒重組質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建質(zhì)粒篇一:學(xué)會構(gòu)建質(zhì)粒這一招，你可以靠賣質(zhì)粒發(fā)家致富啦！

你是否曾遇到這樣的問題，老板讓你討論一個(gè)新的基因，你需要用到這個(gè)基因的質(zhì)粒，可是試驗(yàn)室沒有師兄師姐討論過，所以光靠換載體這點(diǎn)技能已經(jīng)不足以讓你構(gòu)建出你所需要的質(zhì)粒了，然而公司的報(bào)價(jià)特殊高，一千兩千還是廉價(jià)的，甚至還有報(bào)價(jià)上萬的質(zhì)粒，并且貨期很長，老板督促你要結(jié)果，或者不情愿花那么多錢給你買質(zhì)粒，這時(shí)候你該怎么辦？今日教的這一招，你以后都可以自己動手從零開頭構(gòu)建質(zhì)粒啦。

構(gòu)建質(zhì)粒，最重要的是兩樣?xùn)|西，一個(gè)是這個(gè)基因的CDS片段，另一個(gè)是空載，對于常做分子克隆的試驗(yàn)室，空載是確定有的啦，沒有的話去隔壁試驗(yàn)室借一點(diǎn)也是沒問題的，所以問題的重心就是CDS片段怎么來！！

RNA大家都提取過吧，做QPCR之前要先從處理過的細(xì)胞中提取RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成CDNA。想到了吧，我們的CDS片段就可以從這一堆CDNA里挑出來，我們用來構(gòu)建質(zhì)粒的CDNA與用來做QPCR的CDNA唯一的不同在于，我們逆轉(zhuǎn)錄用的酶不一樣，在這里給大家推舉一款：

全式金的AT321

TransScriptTM

II

All-in-One

First-Strand

cDNASynthesis

SuperMix

for

PCR

用你手上有的細(xì)胞提取RNA，接著用此酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得CDNA，之后就可以用這個(gè)CDNA作為模板來進(jìn)行后面的試驗(yàn)了。有時(shí)候可能在某個(gè)細(xì)胞株中你所需要的基因恰好是有突變的，這時(shí)候你可以換個(gè)細(xì)胞株試試，也可以嘗試把突變的地方再突變回來。

接著我們以KLF4基由于例來構(gòu)建質(zhì)粒：

1、首先在PUBMED中找到KLF4的CDS序列，在GENE中搜尋KLF4，選擇HOMO，點(diǎn)擊進(jìn)入

2、進(jìn)入下面這個(gè)頁面之后，始終往下拉，

3、拉到這個(gè)位置，選擇自己需要的轉(zhuǎn)錄本，在這里我選擇第一個(gè)，點(diǎn)擊進(jìn)入

4、頁面如下，往下拉，觀察CDS，點(diǎn)擊CDS可以使此基因的CDS序列顯示為高亮文本，如圖

5、為了可以完整的把CDS序列P出來，所以我們的引物應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)在高亮文本以外的區(qū)域，打開Primer-BLAST來設(shè)計(jì)引物

6、將剛才查到的全部的序列復(fù)制粘貼入輸入框中，輸入引物的范圍，產(chǎn)物的大小，最小為CDS的長度，最大為貼入這段序列的長度

7、點(diǎn)擊GETPrimers

8、選擇一對副產(chǎn)物少的引物就好了

9、引物合成后，就可以以CDNA為模板P出你想要的片段了。PCR結(jié)束之后跑DNA膠，看產(chǎn)物大小是否正確，若正確，進(jìn)行切膠回收，便可進(jìn)行下一輪的PCR。

10、其次次PCR使用的引物設(shè)計(jì)方法就跟換載體那種構(gòu)建質(zhì)粒的方法一樣啦（同源重組法或者T4連接法都可以），不同的地方是，換載體的時(shí)候，我們使用的模板是已有我們基因序列的質(zhì)粒，在這里我們使用的是第九步中的PCR產(chǎn)物。

11、在第十步中得到的PCR產(chǎn)物切膠回收后，再與酶切好的載體連接，之后做轉(zhuǎn)化，長出克隆后進(jìn)行測序，測序勝利之后就大功告成了。

策到這，相信大家已經(jīng)把握這項(xiàng)新技能了吧！抓緊試一試，然后發(fā)家致富吧！

構(gòu)建質(zhì)粒篇二:兩大方法幫你搞定質(zhì)粒構(gòu)建

質(zhì)粒構(gòu)建是分子生物學(xué)討論中最常用的試驗(yàn)技術(shù)。原理依靠于限制性核酸內(nèi)切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對目的基因和載體DNA進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后，將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)。

質(zhì)粒構(gòu)建方式多樣，常規(guī)的T4連接酶，以及最近更受歡迎的重組酶方式。下面我就總結(jié)一下T4連接酶與重組酶構(gòu)建質(zhì)粒方法，通過比較，其最大的不同點(diǎn)可能在于目的基因的設(shè)計(jì)以及連接體系。

壹

一.

T4DNALigase即T4DNA連接酶，可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之間以磷酸二酯鍵結(jié)合，該催化反應(yīng)需ATP作為幫助因子。

1.質(zhì)粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切，一般推舉使用雙酶切。其實(shí)目的就只有一個(gè)，盡量使載體的末端具有特異性，防止自連。

[可選酶切體系]

VECTOR

3ug

CutSmartBuffer

5ul

限制性內(nèi)切酶1

1ul

限制性內(nèi)切酶2

1ul

酶切體系一般選擇50ul，試劑加好之后37°C孵育6~8小時(shí)，或適當(dāng)延長時(shí)間，保證質(zhì)粒酶切完全。每隔一段時(shí)間振蕩一下并離心以防液滴蒸發(fā)至管蓋上。酶切后載體通過切膠回收線性化載體。

2.依據(jù)目的序列構(gòu)建引物后，引物設(shè)計(jì)原則簡潔總結(jié)一下:

（1）前向引物：5’端-愛護(hù)堿基序列+限制性內(nèi)切酶1酶切位點(diǎn)序列+基因正向引物序列-3’端

（2）反向引物：5’端-愛護(hù)堿基序列+限制性內(nèi)切酶2酶切位點(diǎn)序列+基因反向引物序列-3’端

假如目的基因片段較長的話，可以選擇PCR方式擴(kuò)增目的基因片段

[可選

PCR

擴(kuò)增體系]

ddH2O：14ul

10xTaqbuffer：2ul

10umDNTP：1ul

10umprimerF：0.5ul

10umprimerR：0.5ul

模板DNA：1ul

Taq

酶：1ul

[可選

PCR

擴(kuò)增條件]

(1)95℃：5min

(2)35cycle

95℃：30s

55℃：30s（退火溫度可以依據(jù)目的引物TM值打算，一般退火溫度根據(jù)引物TM值降低5度）

72℃：40s

(3)72℃：10min

(4)16℃：hold

引物擴(kuò)增之后，首先要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證條帶大小，然后通過膠回收，獲得純化目的片段產(chǎn)物.由于加入愛護(hù)堿基，回收產(chǎn)物需要進(jìn)行雙酶切，雙酶切方法與質(zhì)粒酶切方法相同。

3.載體與目的基因的連接，推舉在

10~20μl

反應(yīng)體系中進(jìn)行接反應(yīng)。

[可選連接體系]

載體

25ng

退火產(chǎn)物

2ul

10xT4buffer

1ul

T4DNAligase

1ul

T4連接酶一般選擇4度過夜

4.轉(zhuǎn)化

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中（一般為DH5a），涂板，培育過夜。

5.挑取單克隆，并鑒定

挑去平板上的單克隆培育，可以通過PCR或者酶切初步鑒定陽性克隆，對初步鑒定出來的陽性克隆進(jìn)行測序。

貳

下面開頭重點(diǎn)介紹重組酶構(gòu)建質(zhì)粒，基于同源基因重組原理，適用于向幾乎任何載體在任何位點(diǎn)進(jìn)行定向克隆，無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點(diǎn)可高效克隆50bp～10kb片段，同時(shí)構(gòu)建時(shí)間也大大縮短。

1.載體的制備一般推舉雙酶切線性化，線性化完全，假陽性克隆低。酶切體系同上。

2.對于使用重組方式連接來說，PCR要設(shè)計(jì)引物,設(shè)計(jì)引物時(shí)要依據(jù)質(zhì)粒載體和基因序列選擇合適的同源序列，通過PCR擴(kuò)增方式進(jìn)行連接，PCR的產(chǎn)物要純化。

引物設(shè)計(jì)原則簡潔總結(jié)一下：

（1）前向引物：5’端--上游克隆載體末端同源序列+基因正向擴(kuò)增引物--3’端

（2）反向引物：3’端--基因反向擴(kuò)增引物+下游克隆載體末端同源序列--5’端

假如設(shè)計(jì)的基因特異插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物長度較長，可以選擇PCR方式進(jìn)行目的引物的擴(kuò)增。

[可選

PCR擴(kuò)增體系]

ddH2O

14ul

10xTaqbuffer

2ul

10umDNTP

1ul

10umprimerF

0.5ul

10umprimerR

0.5ul

Vector

1ul

Taq酶

1ul

[可選

PCR擴(kuò)增條件]

(1)95℃：5min

(2)35cycle

95℃：30s

55℃：30s（退火溫度可以依據(jù)目的引物TM值打算，一般退火溫度根據(jù)引物TM值降低5度）

72℃：40s

(3)72℃：10min

(4)16℃：hold

PCR擴(kuò)增后，通過膠回收方式獲得純化的PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物不需要進(jìn)行酶切，直接用于重組反應(yīng)。

3.目的引物與線性載體進(jìn)行重組反應(yīng)。

[可選重組體系]

5×CEIIBuffer

4μl

線性化克隆載體

50～200ng

插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物

20～200ng

Exnase?

II

2μl

ddH2O

xul

在冰水浴中配制，配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，置于37℃反應(yīng)30min。待反應(yīng)完成后，馬上將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻5min。重組效率在反應(yīng)30min左右達(dá)到最高，反應(yīng)時(shí)間不足或者太長都將會降低克隆效率，這樣大大削減了連接時(shí)間。

4.轉(zhuǎn)化

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中（一般為DH5a），涂板，培育過夜。

5.挑取單克隆，并鑒定

挑去平板上的單克隆培育，可以通過PCR或者酶切初步鑒定陽性克隆，對初步鑒定出來的陽性克隆進(jìn)行測序。

最終，幾個(gè)主要留意事項(xiàng)：

1.載體克隆位點(diǎn)選擇盡量選擇無重復(fù)序列，且GC含量比較勻稱的區(qū)域進(jìn)行克隆。當(dāng)克隆位點(diǎn)上下游20bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%～60%范圍之內(nèi)時(shí)，克隆效率將達(dá)到最大.

2.最適克隆載體與插入片段摩爾比為1:2，即最適插入片段使用量為0.06pmol。這些摩爾數(shù)對應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式粗略計(jì)算獲得：

最適克隆載體使用量=[0.02×克隆載體堿基對數(shù)]ng（0.03pmol）

最適插入片段使用量=[0.04×插入片段堿基對數(shù)]ng（0.