羊A型產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR和ELISA檢測技術(shù)規(guī)程

羊A型產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR和ELISA檢測技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了羊A型產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR和ELISA檢測方法的技術(shù)規(guī)范。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于羊A型產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR和ELISA的檢測。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB14925實驗動物環(huán)境及設(shè)施術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。一抗酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）中用于與包被的抗原結(jié)合的抗體稱為一抗。陰陽性血清和待檢血清統(tǒng)稱為一抗。二抗酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）中用于與一抗結(jié)合的抗抗體稱為二抗。本標(biāo)準(zhǔn)中兔抗羊IgG抗體為二抗。試劑或材料產(chǎn)氣莢膜梭菌使用A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC41。產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清羊經(jīng)免疫產(chǎn)氣莢膜梭菌抗原3次后獲得的血清，每次免疫間隔兩周。抗體中和試驗檢測效價高于1:256（附錄A）。陰性血清從健康的未感染未免疫的羊分離的血清（附錄A）。生化試劑滅菌0.5%石炭酸生理鹽水、PBS、PBST、Tris-HCL、牛血清白蛋白（BSA）、底物反應(yīng)液（具體配制方法見附錄B）；PCRbuffer；dNTP；Taq聚合酶；溴酚藍；二甲苯青；蔗糖；Tris-乙酸；乙二胺四乙酸（EDTA）；溴化乙錠；X脂糖；Tween-20；考馬斯亮藍G-250；考馬斯亮藍R-250；鄰苯二胺（OPD）；30%丙烯酰胺；十二烷基硫酸鈉（SDS）；過硫酸銨（AP）；四甲基乙二胺（TEMED）；甲醛溶液；FT培養(yǎng)基；產(chǎn)毒培養(yǎng)基；酵母浸膏粉；蛋白胨；L-精氨酸；糊精。水試驗用水符合GB/T6682三級水的規(guī)定。儀器設(shè)備微量移液器：量程為20μL～100μL。PCR管：200μL體積。滅菌吸管：1.0mL。恒溫培養(yǎng)箱。勻速振蕩器。離心機：轉(zhuǎn)速不低于16000r/min。96孔ELISA酶標(biāo)板。PCR儀。酶標(biāo)儀：波長范圍340nm～850nm。分光光度計。玻璃比色皿。產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR檢測方法本檢測方法在200μL的離心管中進行，所使用的引物如下：產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR引物序列PrimersPrimersequence（5’-3’）Size（bp）CPA-FTATGAATGGCAAAGAGGA589CPA-RACTAAAATACTGACCTTC所用的上樣緩沖液為：質(zhì)量/體積比為0.25％的溴酚藍，質(zhì)量/體積比為0.25%的二甲苯青，質(zhì)量/體積比為40%的蔗糖水溶液。所用的含溴化乙錠的X脂糖凝膠為由0.04M的Tris-乙酸和0.001M的乙二胺四乙酸（EDTA）組成的TAE緩沖液配制的，其中含0.5μg/mL的溴化乙錠和質(zhì)量/體積比為1.5%X脂糖。試驗步驟如下：將過夜培養(yǎng)的病原菌，采用細菌基因組DNA提取試劑盒抽提細菌的基因組DNA；以上述細菌基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體系（50μL）為：10×PCRbuffer（含Mg2+）5.0μL、2.5mmol/LdNTP4.0μL、Taq聚合酶0.3μL、模板為2.0μL、引物濃度為10pmol/μL，用補齊至50μL；PCR擴增反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃7min；94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s，30個循環(huán)；產(chǎn)物末端72℃延伸10min；PCR擴增產(chǎn)物加入上樣緩沖液后，再加樣于含0.5μg/mL溴化乙錠的1.5％X脂糖凝膠中，進行X脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果判定紫外成像儀下觀察PCR產(chǎn)物凝膠電泳，如果出現(xiàn)589bp的目的條帶（如圖1），則判定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。PCR目的條帶圖示M代表DNAMarker；1，2，3，4代表檢測樣本。ELISA檢測方法包被包被：將產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白用包被液（0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋成10μg/mL，包被酶標(biāo)板。封閉用PBST洗滌酶標(biāo)板5次。每孔加入封閉液（含1%BSA的PBS）200μL，置于濕盒內(nèi)，4℃封閉過夜。一抗孵育用PBST洗滌酶標(biāo)板5次。取1孔加入1:10倍稀釋羊抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素高免血清作為陽性對照（制備方法見附錄B），取1孔加入1:10倍稀釋的羊陰性血清作為陰性對照（制備方法見附錄B）；其它孔加1:10稀釋的待檢血清，置濕盒內(nèi)37℃作用60min。抗體稀釋液為1℅BSA的PBS。二抗孵育用PBST洗滌酶標(biāo)板5次。加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG（抗體稀釋液為1℅BSA的PBS），置濕盒內(nèi)37℃作用45min。底物顯色用PBST洗滌酶標(biāo)板5次。加底物反應(yīng)液，置濕盒內(nèi)37℃避光顯色20min。讀數(shù)最后用2.0mol/L的H2SO4溶液終止反應(yīng)，以酶標(biāo)儀檢測樣品的OD490值。結(jié)果判定以待測孔的OD值大于或等于陰性對照孔的2倍者，即P/N大于或等于2判為陽性，重復(fù)3次計算平均值。

（資料性附錄）

羊產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的提取和抗血清的制備羊產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白的提取將保存的羊A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株（CVCC41）接種于200mLFT培養(yǎng)基中進行增菌，37℃厭氧培養(yǎng)12h。將增菌液以5%的比例接種到產(chǎn)毒培養(yǎng)基（配制方法見附錄A）中，43℃厭氧培養(yǎng)5h-6h進行產(chǎn)毒。產(chǎn)毒結(jié)束，離心（12000r/min，30min）取上清，離心后用0.22μm的濾器過濾取上清。將過飽和硫酸銨溶液緩慢加入到上述所制得上清中，使其終濃度達到40%，4℃靜置過夜。離心（10000r/min，20min）保留沉淀，用同體積的含2%TritonX-100的Tris-MgCL2緩沖液溶解。溶解完成后，向管內(nèi)加入過飽和硫酸銨溶液使其終濃度為40%，再次離心方法同上，最后取3.0mL0.05M的Tris-HCL緩沖液（PH=7.5）溶解沉淀。羊產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白含量測定采用Bradford方法，具體操作步驟如下：取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0mL、0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL，然后用無離子水補充到0.1mL；最后各試管中分別加入5.0mL考馬斯亮蘭G-250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（不能太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）；加完試劑2min-5min后，即可開始用玻璃比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對照為第1號試管，即0.1mL水加5.0mL考馬斯亮蘭G-250試劑。比色皿使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡；用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/mL溶液的A595約為0.50。微量法：當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時（10mg/mL-100mg/mL），可將取樣量（包括補加的水）加大到0.5mL或1.0mL，空白對照則分別為0.5mL或1.0mL水，考馬斯亮藍G-250試劑仍加5.0mL，同時作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/mL溶液的A595約為0.29。羊產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）檢測聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）采用解離非連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直板電泳。使用濃縮膠為5%，分離膠為12%的不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠（附錄B）。電泳結(jié)束，采用考馬斯亮藍R-250染色，以標(biāo)準(zhǔn)低蛋白分子量的對數(shù)值和電泳遷移率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各蛋白分子量。產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗血清的制備將甲醛緩慢的加入到含有α毒素的溶液中使甲醛終濃度達到0.3%，混勻后，在37℃條件下將外毒素滅活96h，期間每隔5h-6h振蕩一次混合液。將滅活的羊產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白液與弗氏不完全佐劑混合（V:V=1:1），用漩渦振蕩器乳化，制備羊產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素免疫用抗原。選取15kg左右的健康未感染未免疫的羊2只，肌肉注射免疫α毒素抗原，共免疫3次，每次間隔2周，α毒素免疫劑量為10mg/只/次。飼養(yǎng)環(huán)境飼養(yǎng)符合GB14925《實驗動物環(huán)境及設(shè)施》國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。最后1次免疫后7d采血，抗體中和試驗檢測血清中羊抗羊產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體的效價，效價高于1：256以上時采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。陰性血清制備采集健康未感染過產(chǎn)氣莢膜梭菌的羊，制備陰性血清。

（規(guī)范性附錄）

溶液的配制滅菌0.5%石炭酸生理鹽水的配制稱取9.0g氯化鈉（NaCl）溶于水，定容到1.0L，再加入5.0mL苯酚。配制后高壓滅菌器滅菌后使用。磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制1mol/LPBS（pH7.2）的配方如下：氯化鈉（NaCL）：8.0g；氯化鉀（KCL）：0.2g；磷酸氫二鈉（Na2HPO4）：1.44g；磷酸二氫鉀（KH2PO4）：0.24g；加水900mL，調(diào)pH等于7.2，定容至1000mL。PBST緩沖液的配制1.0LPBS+1.0mLTween-20。牛血清白蛋白（BSA）將100mg的牛血清白蛋白加入9.5mL水中（須將蛋白加入水中，而不是將水加入蛋白中），蓋好蓋后，輕輕搖動，直至牛血清白蛋白完全溶解為止。加水定容到10mL，然后分裝成小份，貯存于-20℃。Tris-HcL緩沖液的配制配方如下：Tris堿：121.1g；濃鹽酸（1mol/LHCl）：42.0mL；水：定容至1000mL。在900mL水中加入121.1gTris堿，溶液冷卻至室溫后調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0，然后定容至1000mL，分裝后高壓蒸汽滅菌30min，室溫保存。5%濃縮膠配制配方如下：水：2.1mL；30%丙烯酰胺：0.5mL；1.0MTris-HCLbuffer：0.38mL；10%SDS：0.03mL；10%過硫酸銨（AP）：0.03mL；TEMED：0.003mL。12%分離膠配制配方如下：水：1.65mL