實驗四電泳技術及詳解演示文稿

實驗四電泳技術及詳解演示文稿當前第1頁\共有45頁\編于星期日\0點（優(yōu)選）實驗四電泳技術及當前第2頁\共有45頁\編于星期日\0點+-1.許多生物分子帶有電荷，在電場中可以發(fā)生移動。2.每種分子遷移率不同，一定時間內在電場中的遷移距離不同。在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時間內它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術進行分離、分析和鑒定的基本原理。原理當前第3頁\共有45頁\編于星期日\0點二、電泳遷移率設一帶電粒子在電場中所受的力為F，則F=QE（Q為粒子所帶電荷，E為電場強度）根據Stoke定律，一球形分子在溶液中運動所受的阻力f為：f=6πrηv（v為分子移動速度；r為分子半徑；η為介質黏度）當前第4頁\共有45頁\編于星期日\0點當分子達到動態(tài)平衡時，F(xiàn)=f即QE=6πrηv移項得v/E=Q/6πrηv/E:表示單位電場強度時粒子運動速度，稱為遷移率，也稱電泳速度，以表示。

因此上式也可表示為：=Q

/6πrη從上式可推知，帶電粒子在電場中的移動與:粒子大小有關，顆粒愈小愈快粒子的電荷有關，電荷愈多愈快粒子的形狀有關，愈接近球形愈快當前第5頁\共有45頁\編于星期日\0點三、影響遷移率的因素1.電場強度（E）

電場強度是指每厘米的電位降。電泳速度與電場強度成正比。電場強度越高電泳速度越快。

根據電場強度大小，電泳可分為：常壓電泳：2～10V/cm高壓電泳：20～200V/cm2.溶液的pH值

pH值決定帶電顆粒的解離程度，決定物質所帶凈電荷的多少。選擇合適pH，使混合物中各成分所帶電量差別較大。

pH>pI帶負電pH<pI帶正電當前第6頁\共有45頁\編于星期日\0點3.溶液的離子強度

緩沖液的離子強度越高，電泳速度越慢一般在0.02-0.2mol/L。4.電滲現(xiàn)象

在電場中液體對固體支持物的相對移動。電泳介質多孔，且?guī)в锌山怆x的化學基團，吸附正離子或負離子，使溶液相對帶電。應盡量避免選用有電滲作用的支持物。當前第7頁\共有45頁\編于星期日\0點四、電泳的分類按電泳的原理來分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質的溶液中進行的電泳。其裝置復雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質的電泳，待分離物質在支持介質上分離成若干區(qū)帶。支持介質的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質不同以及技術上的差異，又可分為不同的類型。當前第8頁\共有45頁\編于星期日\0點根據支持介質物理形狀不同（1）濾紙及其它纖維素薄膜電泳（2）凝膠電泳（3）粉末電泳（4）線絲電泳

根據支持介質的裝置形式（1）平板式電泳

（2）垂直板式電泳（3）連續(xù)式電泳（4）圓盤電泳

根據pH連續(xù)性與否（1）連續(xù)pH電泳（2）非連續(xù)pH電泳

當前第9頁\共有45頁\編于星期日\0點瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質只有很小的分子篩效應。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質當前第10頁\共有45頁\編于星期日\0點五、瓊脂糖凝膠電泳特點1.具有大量微孔

孔徑大小取決于濃度：0.075%濃度孔徑800nm0.16%濃度孔徑500nm1%濃度孔徑150nm2.具有較高的機械強度可以在1%或更低濃度下使用3.無毒，不需要催化劑4.具有熱可逆性，低熔點瓊脂糖回收樣品容易5.膠凝溫度34-43℃熔化溫度75-90℃低熔點瓊脂糖膠凝溫度低于30℃(融化溫度高于30℃)當前第11頁\共有45頁\編于星期日\0點電極緩沖液TAE:40mM/LTris-醋酸1mM/LEDTA5×:24.2克Tris5.7ml冰醋酸10ml0.5M/LEDTATBE:45mM/LTris-硼酸1mM/LEDTA5×:54克Tris27.5克硼酸10ml0.5M/LEDTA當前第12頁\共有45頁\編于星期日\0點瓊脂糖凝膠電泳優(yōu)點：1.雙重效應：電泳效應、分子篩效應。2.操作簡單，電泳速度快，樣品無需預處理。3.電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。4.凝膠透明且無紫外吸收，可在紫外燈下觀看結果。5.易染色，易洗脫，便于定量。

瓊脂糖凝膠電泳一般用于核酸的分離分析。當前第13頁\共有45頁\編于星期日\0點瓊脂糖凝膠分離范圍瓊脂糖濃度%線狀DNA分子分離范圍Kb0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2當前第14頁\共有45頁\編于星期日\0點當前第15頁\共有45頁\編于星期日\0點六、等點聚焦1.用兩性電解質建立電場中連續(xù)線性pH梯度2.只適用于兩性解離的物質電泳pH1018642pI—＋當前第16頁\共有45頁\編于星期日\0點當前第17頁\共有45頁\編于星期日\0點當前第18頁\共有45頁\編于星期日\0點七、雙向電泳

(2-DE)當前第19頁\共有45頁\編于星期日\0點蛋白印跡(westernblotting)檢測血清中的免疫球蛋白當前第20頁\共有45頁\編于星期日\0點一、概念

通過PAGE/SDS分離樣品中不同的蛋白質組分，利用電轉移法將電泳分離的蛋白質從凝膠轉移至一種固相支持物，然后用免疫學原理來檢測目的蛋白質。常用于檢測樣品中特異蛋白的存在、以及半定量分析。當前第21頁\共有45頁\編于星期日\0點制備蛋白樣品SDS轉膜免疫學檢測二、工作流程

封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色/發(fā)光當前第22頁\共有45頁\編于星期日\0點1.蛋白樣品的獲得來源：組織、細胞、體液方法：可用各種蛋白裂解液當前第23頁\共有45頁\編于星期日\0點聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）聚合交聯(lián)成三維網狀結構的凝膠。以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE）。PAGE靈敏度高（ug），分辨率高（幾個bp）。

PAGE電泳體系中加入SDS--→SDSPAGE應用范圍廣，可用于蛋白質、酶、核酸等生物大分子的分離、定性、定量及少量制備，還可測定分子量、等電點等。2.SDS當前第24頁\共有45頁\編于星期日\0點2.1聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用；(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g;(6)凝膠孔徑可調節(jié)，根據被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調節(jié)凝膠的孔徑;(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。當前第25頁\共有45頁\編于星期日\0點分子量范圍與凝膠濃度的關系分子量范圍適用的凝膠濃度(%)蛋白質1041～4×1044×104～1×1051～5×1055×10520～3015～2010～155～102～5核酸104104～105105～2×10615～205～102～2.6當前第26頁\共有45頁\編于星期日\0點2.2聚丙烯酰胺凝膠的制備

Acr和Bis單獨存在或混合在一起時是穩(wěn)定的，但在自由基存在時就會發(fā)生聚合反應形成凝膠。引發(fā)產生自由基的方法有化學和光聚合兩種方法。1）化學聚合常用的催化劑系統(tǒng)有：

（1）過硫酸胺（AP）——TEMED(四甲基乙二胺)；（2）過硫酸胺——DMPN(二甲基氨基丙腈)；（3）過硫酸胺——三乙醇胺。2）光聚合由光敏物質核黃素代替過硫酸銨作催化劑。當前第27頁\共有45頁\編于星期日\0點影響聚合反應的因素：（1）大氣氧能淬滅自由基，抑制聚合。在進行化學聚合前，一般在膠液表面，覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。（2）低溫、低pH都會減慢聚合反應速度。（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應。（4）過硫酸銨易潮解失效。當前第28頁\共有45頁\編于星期日\0點2.3SDS分離蛋白的原理電泳體系由濃縮膠、分離膠及電極緩沖液組成。

①濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.8的Tris-HCl。

②分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.8Tris-HCl。③電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。

2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性→→樣品濃縮的主要因素。

當前第29頁\共有45頁\編于星期日\0點SDS分離蛋白的特點1)樣品濃縮效應(a)凝膠孔徑不連續(xù)性；(b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性；(2)分子篩效應(3)電荷效應8.38.38.86.8當前第30頁\共有45頁\編于星期日\0點2.4十二烷基磺酸鈉（SDS）的作用SDS：陰離子表面活性劑，能夠使蛋白質的氫鍵和疏水鍵打開，并結合到蛋白質上（結合比為1.4gSDS/1g蛋白質）使各種蛋白質-SDS復合物都帶有相同密度的負電荷，其數(shù)量遠遠超過了蛋白質分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質間原有的電荷差別。此時蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于其分子量大小。可以利用SDS測定蛋白質分子量。實驗中同時加入巰基乙醇（強還原劑），使蛋白質分子中的二硫鍵保持還原狀態(tài)，利于蛋白質和SDS定量結合。當前第31頁\共有45頁\編于星期日\0點3.轉膜實現(xiàn)蛋白從凝膠到膜的轉移常用的固相支持物：NC膜,PVDF膜轉膜方法：電轉移法（濕法、半干法）轉膜裝置：夾心三明治結構(陰極碳極板、海綿、濾紙、凝膠、NC膜、濾紙、海綿、陽極碳極板)，180mAX2hrs/100vX1hr轉膜效果檢測：①膜的檢測：麗春紅染膜；應用預染蛋白Marker②凝膠的檢測：考馬斯亮藍染色轉膜后的膠當前第32頁\共有45頁\編于星期日\0點4.免疫學檢測封閉：5%脫脂奶粉或BSA，封閉非特異結合位點。一抗孵育：一抗與封閉液以一定稀釋度配比。二抗孵育：用與一抗種屬相同的二抗進行孵育。檢測：利用二抗上的標記物（AP/HRP）可以使底物顯色或發(fā)光來檢測蛋白。注意事項：①一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白質要經過預實驗確定。②底物溶液要新鮮配制。③帶手套操作，避免樣品污染，也保護自己。當前第33頁\共有45頁\編于星期日\0點SDS-當前第34頁\共有45頁\編于星期日\0點三、儀器、原料和試劑試劑：10%SDS、凝膠貯存液（30%ACr-Bis）、分離膠緩沖液（1.5mol/LpH8.8Tris-HCl緩沖液）、濃縮膠緩沖液（1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液）、10%過硫酸銨、TEMED、pH8.3Tris-Gly電極緩沖液、0.05%考馬斯亮蘭R250器材：垂直板電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、脫色搖床原料：血清蛋白樣品當前第35頁\共有45頁\編于星期日\0點當前第36頁\共有45頁\編于星期日\0點四、實驗步驟1、安裝夾心式垂直板電泳槽

：注意：安裝前，膠條、玻璃板都要潔凈干燥；勿用手接觸灌膠面的玻璃。2、配膠：根據所測蛋白質分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。3、制備凝膠板（1）分離膠制備（10%分離膠，20ml/電泳槽）（2）濃縮膠的制備（5%濃縮膠，10ml/電泳槽）當前第37頁\共有45頁\編于星期日\0點當前第38頁\共有45頁\編于星期日\0點當前第39頁\共有45頁\編于星期日\0點4、樣品的處理及加樣將血清樣品