試談DNA重組技術(shù)的基本工具

DNA重組技術(shù)的基本工具復(fù)習(xí)：DNA分子的結(jié)構(gòu)：（磷酸二酯鍵）基因概念：基因在染色體上排列特點(diǎn)：基因的功能：基因的結(jié)構(gòu)：基因工程是指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì),通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù),賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。又叫做DNA重組技術(shù)。（一）基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程實(shí)質(zhì)（原理）結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平定向地改造生物的遺傳性狀，產(chǎn)生人類(lèi)需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因重組一種限制酶只能識(shí)別一種特定脫氧核苷酸序列；并在特定位點(diǎn)切割。一.限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”（二）基因工程的基本工具1、來(lái)源：2、種類(lèi)：3、作用：主要是原核生物4000種。4、作用實(shí)質(zhì)：斷開(kāi)磷酸二酯鍵5、結(jié)果：形成兩種末端粘性末端平末端ＥcoRI限制酶SmaI限制酶識(shí)別序列－ＣＣＣＧＧＧ－切割位點(diǎn)Ｇ和Ａ之間Ｃ和Ｇ之間未端類(lèi)型平末端粘性末端－ＣＴＴＡＡＧ－－ＧＧＧＣＣＣ－－ＧＡＡＴＴＣ－要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。

被同一種限制酶切斷的幾個(gè)來(lái)源不同的DNA是否具有相同的黏性末端？?jī)蓚€(gè)不同的ＤＮＡ的黏性末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。被同一種限制酶切斷的幾個(gè)DNA具有相同的黏性末端。二.DNA連接酶——“分子縫合針”1.作用：把兩條ＤＮＡ末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，恢復(fù)斷開(kāi)了的磷酸二酯鍵。2.來(lái)源大腸桿菌中分離的E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端T4噬菌體中提取的T4DNA連接酶兩種末端都可以連接3.DNA聚合酶和DNA連接酶有何相同和不同點(diǎn)？（1）DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個(gè)核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。（2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)。因此DNA連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——”分子運(yùn)輸車(chē)”１、作用：將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞２、特點(diǎn)（條件）1、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存2、有適宜的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，最好是對(duì)多種限制性?xún)?nèi)切酶有單一切點(diǎn)3、具有標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選4.對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害３、常用的運(yùn)載體：質(zhì)粒（最常用）、λ噬菌體的衍生物和動(dòng)植物病毒等質(zhì)粒:是一種裸露的,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外,并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。工具限制性?xún)?nèi)切酶DNA連接酶載體來(lái)源原核生物大腸桿菌、T4噬菌體細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等化學(xué)本質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)環(huán)狀DNA分子（質(zhì)粒）作用錯(cuò)位切：產(chǎn)生黏性末端平切：產(chǎn)生平末端連接同一種限制酶的切口（實(shí)質(zhì)：恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的磷酸二酯鍵）（與DNA聚合酶進(jìn)行區(qū)別）運(yùn)載目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞特點(diǎn)專(zhuān)一性?xún)煞NDNA連接酶作用性質(zhì)稍有差別自我復(fù)制多酶切位點(diǎn)有標(biāo)記基因?qū)κ荏w細(xì)胞無(wú)害備注“分子手術(shù)刀”根據(jù)切點(diǎn)不同，分類(lèi)不同“基因縫合針”“分子運(yùn)輸車(chē)”識(shí)別特定脫氧核苷酸序列，并在特定位點(diǎn)切割（實(shí)質(zhì)：斷裂磷酸二酯鍵）在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（）Ａ．同種限制酶B.兩種限制酶Ｃ．同種連接酶D.兩種連接酶練習(xí)Ａ注意：要用同一種限制酶切取目的基因和運(yùn)載體，并用DNA連接酶連接。不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是A、能復(fù)制（）B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)C、具有標(biāo)記基因D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)雙基練習(xí)：一、基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì),通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù),賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。又叫做DNA重組技術(shù)。二、DNA重組技術(shù)的基本工具1.限制性核酸內(nèi)切酶-----”分子手術(shù)刀”(1)主要來(lái)源:從原核生物中分離出來(lái)的.(2)特點(diǎn):能夠識(shí)別DNA特定的核苷酸序列,切開(kāi)兩個(gè)____之間的_____.(3)DNA末端:限制酶切割DNA產(chǎn)生的DNA末端有兩種形式:______和_______.2.DNA連接酶----”分子縫合針”作用:將雙鏈DNA____,恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的______.

3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體----”分子運(yùn)輸車(chē)”(1)載體的種類(lèi)①質(zhì)粒:是一種裸露的,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外,并具有自我_____能力的雙鏈______DNA分子;②λ噬菌體的衍生物;③________.(2)載體的特點(diǎn)①能夠在細(xì)胞內(nèi)_______;②有一個(gè)或多個(gè)____切割位點(diǎn),便于供源DNA的插入.③具有_____基因,供重組DNA的鑒定和選擇.假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？作為載體沒(méi)有切割位點(diǎn)將怎樣？目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察覺(jué)？如果載體對(duì)受體細(xì)胞有害將怎樣？如果不能分離會(huì)怎樣？思考：對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害，易分離．《化妝品術(shù)語(yǔ)》起草情況匯報(bào)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所一、標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)和下達(dá)時(shí)間2006年衛(wèi)生部政法司要求各標(biāo)委會(huì)都要建立自己的術(shù)語(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)。1ONE二、標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)研制經(jīng)費(fèi)：3.8萬(wàn)三、標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)意義術(shù)語(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)有利于行業(yè)間技術(shù)交流、提高標(biāo)準(zhǔn)一致性、消除貿(mào)易誤差，作為標(biāo)準(zhǔn)體系中的基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)語(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)在各個(gè)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)體系中均起著重要的作用。隨著我國(guó)化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)逐步加快，所涉及的術(shù)語(yǔ)和定義的數(shù)量也在迅速增長(zhǎng)，在此情形下，化妝品術(shù)語(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)的制定就顯得尤為重要。四、標(biāo)準(zhǔn)的制訂原則1.合法性遵守《化妝品衛(wèi)生監(jiān)督條例》、《化妝品衛(wèi)生監(jiān)督條例實(shí)施細(xì)則》中關(guān)于化妝品的定義。2.協(xié)調(diào)性直接引用或修改采用的方式，與相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的術(shù)語(yǔ)和定義相協(xié)調(diào)。3.科學(xué)性對(duì)于沒(méi)有國(guó)標(biāo)或定義不統(tǒng)一的術(shù)語(yǔ)，在定義時(shí)體現(xiàn)科學(xué)性的原則。4.實(shí)用性在標(biāo)準(zhǔn)體系中出現(xiàn)頻率較高，與行業(yè)聯(lián)系較緊密的術(shù)語(yǔ)優(yōu)先選用。五、標(biāo)準(zhǔn)的起草經(jīng)過(guò)

第一階段：資料搜集

搜集國(guó)內(nèi)外相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)并對(duì)國(guó)外文獻(xiàn)如美國(guó)21CFR進(jìn)行翻譯。第二階段：2007年末形成初稿

初稿內(nèi)容包括一般術(shù)語(yǔ)、衛(wèi)生化學(xué)術(shù)語(yǔ)、毒理學(xué)術(shù)語(yǔ)、微生物術(shù)語(yǔ)、產(chǎn)品術(shù)語(yǔ)、人體安全和功效評(píng)價(jià)術(shù)語(yǔ)，常用英文成份術(shù)語(yǔ)等７部分。第三階段：專(zhuān)家統(tǒng)稿1.2007年12月第一次專(zhuān)家統(tǒng)稿會(huì)（修訂情況：1.在結(jié)構(gòu)上增加原料功能術(shù)語(yǔ)、相關(guān)國(guó)際組織和科研機(jī)構(gòu)等內(nèi)容；2.在內(nèi)容上增加一般術(shù)語(yǔ)、產(chǎn)品術(shù)語(yǔ)的種類(lèi)，將化妝品行業(yè)的新產(chǎn)品類(lèi)別納入本標(biāo)準(zhǔn)；3.對(duì)于毒理學(xué)、衛(wèi)生化學(xué)、微生物學(xué)術(shù)語(yǔ)進(jìn)行修改；4.刪除與化妝品聯(lián)系不緊密、無(wú)存在必要的常用英文成分術(shù)語(yǔ)。2.2009年1月第二次專(zhuān)家統(tǒng)稿會(huì)會(huì)議意見(jiàn)：1.修改能引用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的盡量引用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)存在歧義的個(gè)別用詞進(jìn)行修改。2.刪除由于本標(biāo)準(zhǔn)中的“產(chǎn)品術(shù)語(yǔ)”一章和香化協(xié)會(huì)所制定的某個(gè)標(biāo)準(zhǔn)存在重復(fù)，因此刪除“產(chǎn)品術(shù)語(yǔ)”一章的內(nèi)容；對(duì)“原料功能術(shù)語(yǔ)”的內(nèi)容進(jìn)行梳理，刪除了20余條內(nèi)容。3.增加專(zhuān)家建議增加“化妝品限用物質(zhì)”等若干項(xiàng)術(shù)語(yǔ)。第四階段：征求意見(jiàn)2009年2月面向全國(guó)公開(kāi)征求意見(jiàn)。第五階段：征求意見(jiàn)的處理與形成送審稿。在征求意見(jiàn)的處理階段再次征求了相關(guān)專(zhuān)家的意見(jiàn)。六、標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容依據(jù)1.《化妝品衛(wèi)生監(jiān)督條例》、《化妝品衛(wèi)生監(jiān)督條例實(shí)施細(xì)則》;2.《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》;3.美國(guó)21CFR；4.相關(guān)領(lǐng)域國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)如：GB5296.3-2008消費(fèi)品使用說(shuō)明化妝品通用標(biāo)簽，GB/T14666-2003分析化學(xué)術(shù)語(yǔ)等；5.國(guó)內(nèi)外化妝品的相關(guān)文獻(xiàn)，如《化妝品監(jiān)督管理及安全性評(píng)價(jià)》等。七、標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和主要內(nèi)容（一）結(jié)構(gòu)：1.范圍2.一般術(shù)語(yǔ)3.毒理學(xué)試驗(yàn)方法術(shù)語(yǔ)4.衛(wèi)生化學(xué)檢驗(yàn)方法術(shù)語(yǔ)5.微生物檢驗(yàn)方法術(shù)語(yǔ)6.人體安全性和功效性評(píng)價(jià)術(shù)語(yǔ)7.常用原料術(shù)語(yǔ)8.縮寫(xiě)9.中英文索引（二）主要內(nèi)容：1).一般術(shù)語(yǔ)39條涉及化妝品的基本定義、化妝品生產(chǎn)和監(jiān)督管理中出現(xiàn)頻率較高的術(shù)語(yǔ)。2).毒理學(xué)試驗(yàn)方法術(shù)語(yǔ)40條收錄了《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中涉及的術(shù)語(yǔ)，以及在毒理學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)頻率較高、與化妝品毒理學(xué)試驗(yàn)方法聯(lián)系較密切的術(shù)語(yǔ)。3).衛(wèi)生化學(xué)檢驗(yàn)方法術(shù)語(yǔ)22條收錄了化妝品的衛(wèi)生化學(xué)檢驗(yàn)方法中較常用的術(shù)語(yǔ)。

4).微生物檢驗(yàn)方法術(shù)語(yǔ)6條收錄了《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中所涉及的術(shù)語(yǔ)。5).人體安全性和功效性評(píng)價(jià)術(shù)語(yǔ)38條收錄了人體安全性和功效性評(píng)價(jià)的常用術(shù)語(yǔ)。6).常用原料術(shù)語(yǔ)55條收錄了常用原料術(shù)語(yǔ)，與《化妝品管理及安全性和功效性評(píng)價(jià)》保持一致，并根據(jù)企業(yè)、專(zhuān)家的意見(jiàn)進(jìn)行了適當(dāng)修改。7).縮寫(xiě)涉及國(guó)際機(jī)構(gòu)縮寫(xiě)以及化妝品毒理學(xué)、化學(xué)、人體安全性和功效評(píng)價(jià)等領(lǐng)域?qū)I(yè)術(shù)語(yǔ)的縮寫(xiě)34條。七、征求意見(jiàn)處理情況2009年2月20日，《化妝品術(shù)語(yǔ)》在全國(guó)公開(kāi)范圍內(nèi)公開(kāi)征求意見(jiàn)，截止到2009年3月末共收到來(lái)自企業(yè)、和社會(huì)各界的意見(jiàn)和建議共146條，分布情況如下：征求意見(jiàn)來(lái)源統(tǒng)計(jì)圖二一般術(shù)語(yǔ)三毒理學(xué)四化學(xué)五微生物六人體七原料八縮寫(xiě)各部分征求意見(jiàn)采納情況統(tǒng)計(jì)圖二一般術(shù)語(yǔ)三毒理學(xué)