中藥有效成分及其類(lèi)似物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用

中藥有效成分及其類(lèi)似物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用研究鮑雅丹馬林**基金項(xiàng)目：中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院第三屆創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)基金項(xiàng)目（批準(zhǔn)號(hào)：02002）資助第一鮑雅丹（1980年出生），女，中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院材料化學(xué)專(zhuān)業(yè)99級(jí)中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院有機(jī)化學(xué)研究所，廣州51027摘要本研究對(duì)從中藥提取的有效成分及合成的一系列類(lèi)似物進(jìn)行了抑制乙酰膽堿酯酶的活性測(cè)試.發(fā)現(xiàn)具有苯環(huán)或共軛結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶有顯著的抑制作用，特別是吲哚喹啉化合物19c的抑制效果最好(IC50=4.8μM)，可以作為治療阿爾茨海默氏病的先導(dǎo)藥物。關(guān)鍵詞乙酰膽堿酯酶抑制劑IC50動(dòng)力學(xué)阿爾茨海默氏病(Alzheimer’sdisease,AD)是常見(jiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，發(fā)病率較高。主要臨床表現(xiàn)為記憶、智力和識(shí)別功能的不同程度的減退或喪失,目前臨床上用于改善AD患者認(rèn)知障礙的藥物主要是乙酰膽堿酯酶抑制劑。在大規(guī)模、多中心、雙盲和安慰劑的對(duì)照試驗(yàn)中,這類(lèi)化合物對(duì)AD病人認(rèn)知能力及生活質(zhì)量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著改善。美國(guó)Warnerlamber公司開(kāi)發(fā)的他克林(tacrine)[1]是一種乙酰膽堿酯酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,1993年經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市,成為第一個(gè)用于治療AD的AChE劑類(lèi)藥物。此后又有數(shù)種AChE抑制劑經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市或進(jìn)入臨床試驗(yàn),如Velnactine、Amiridine等。但它們均有不同程度的毒副作用,這些毒副作用嚴(yán)重影響了它們?cè)谂R床上的應(yīng)用,這使得有必要開(kāi)發(fā)療效高毒副作用更小的AChE抑制劑。乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE,EC3.1.1.7.)的主要生理功能為通過(guò)快速水解神經(jīng)傳遞介質(zhì)乙酰膽堿（ACh），中止膽堿能突觸中的脈沖傳遞，故AChE又稱(chēng)乙酰膽堿水解酶(acetylcholinehydrolase)[2]。CH3COOCH2CH2N+(CH3)3+AChECH3CO-AChE+HOCH2CH2N+(CH3)3CH3COO-+H++AChE為了篩選出高效、低毒的AChE抑制劑，我們參考各種AChE抑制劑的結(jié)構(gòu)類(lèi)型，研究了從中藥山芝麻和筋骨草分離出的有效成分及其類(lèi)似物對(duì)AChE的抑制作用。1實(shí)驗(yàn)部分1.1材料與儀器乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE,EC3.1.1.7.)、硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine)、5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)購(gòu)于Sigma公司；其它試劑為分析純?cè)噭?，未?jīng)進(jìn)一步純化。主要測(cè)試儀器：UV-2501PC型紫外光譜儀、OrionModel720A型pH計(jì)、Guntw28恒溫水浴鍋。1.2方法1.2.1抑制劑的制備：全合成化合物19(a-j)由本實(shí)驗(yàn)室周金林博士提供；化合物1-18由郭新東博士提供從中藥山芝麻和筋骨草中分離的有效成分，結(jié)構(gòu)如下：奮1勤渾截絮幻序爪騙啦樓拳柜呆混葛2秤胃嗓斧館匹揉番辱差僅頑衣3夫狼授榜弟驗(yàn)4難辯汪灰差滋傘冤繞蟲(chóng)仰醉雷搖5出童疊疊皺押朽曾遞變挖爽例籠呼鳥(niǎo)6飲7志笛少薦遷談?dòng)?xùn)紛多洋扁蘿恰奸梢桐8僅鞭櫻荒灰譜石語(yǔ)亮待顧肯茂摘匯伙9生10來(lái)寸粉蒙悠暢獅功輪1賺1吳馬旋盞倒茂斥罰坊12輛漿授尤渣露惡綢航剛13計(jì)眉稀臭瞎寇撤鎖14木池邪想河15孕只啄愛(ài)捕哨折1米6取昨問(wèn)旋重范答省資17島紛烈裁酸惱哈烤鋸1稼8遵1.略2.吐2暑化合爽物對(duì)輩乙酰氧膽堿憤酯酶杰的抑粘制活誤性測(cè)指定澆取5仙支1具.5晚m脊L分肆別裝熊有8艇40社L銅0璃.1暴M室p果H父8.避0磷彎酸鹽敬緩沖劈溶液霸的梨警型管禮，依此次加匙入0驅(qū)，5夾，1釣0，爆20損，3偵5，京50抓L炎1毯.0猴m頑M的賄樣品區(qū)DM崖SO舅溶液至，并縱用D蔑MS蛾O補(bǔ)欲齊至純總體炮積為國(guó)89幅0愧L些。分強(qiáng)別加鏡入5預(yù)0偷明L燙4稿mg庸/m斬L率5,只5壓-二技硫代夏雙衰(2伴-術(shù)硝基崖苯甲絮酸舒)和碎10艦L乙撐酰膽難堿酯銀酶溶耐液（跌0.讀1m僅g/骨ml寧），目并在野37?！婢媳孛?5祥m錯(cuò)in洲。立怪即加姓入5意0柜μ溫L2牌m云g/舍mL預(yù)硫代魚(yú)乙酰些膽堿子溶液威，搖錦勻后冠測(cè)其熔在道λ善=奔41晃2廉nm左處的昏A值臟(A掀n捉)。滔參比偉用0套.1坐M木p筆H生8.雜0磷貓酸鹽釣緩沖賠溶液標(biāo)。以欺未加豐樣品環(huán)所測(cè)固得的督A斗co陷nt創(chuàng)ro繡l糖值作禁為1亦00帳個(gè)活蛾力單閑位：此相對(duì)抹酶活鋒力＝竟(A開(kāi)n三/忽A糠co鋤nt佛ro邀l草)隱×角10墻0歲然后敗以酶否的相償對(duì)活津力對(duì)披抑制技劑濃腳度作由圖，撿根據(jù)勻抑制輪曲線暈求得信各種蝕化合文物的寇IC帥50掩值（勁抑制某酶活妥力5省0％帝時(shí)的躬抑制怨劑濃敲度）榴。館1.尋2.懸3旗乙酰喘膽堿律酯酶鋼的抑贈(zèng)制動(dòng)傻力學(xué)暴測(cè)定山取5眉支1貢.5慢m照L分伏別裝小有8近40幅，8閘55墾，8唐65沙，8餐80料，8就85飼L扇0.旋1罰M權(quán)pH錘8斗.0沙磷酸照鹽緩界沖溶渾液的叫梨型伐管，泰加入血一定蹦量的辯樣品翠溶液其，并重用D象MS捏O補(bǔ)榨齊至絨總體收積的暫5％宇。分械別加轉(zhuǎn)入5槐0衡L杯4宜mg纖/m熔L鵲5,赤5遺副-二板硫代今雙騾(2獄-敞硝基袋苯甲紅酸訂)和翼10用L乙塑酰膽盾堿酯身酶溶紗液，玉并在比37若℃差保溫暴15燦m蠻in孝。立主即分蘇別加朋入5肚0，我35懷，2抄5，賀10伸，5微L2哪m壽g/病mL柔硫代績(jī)乙酰粱膽堿撓溶液餃，搖響勻后值測(cè)其淚在量λ耽=4吹12困n唇m處啦的時(shí)誕間掃種描曲幼線。它曲線悶的斜塞率即器為反唉應(yīng)的瞇初速怪度[李V]村，然培后以陵1/盲[V腰]對(duì)昨1/謀[S狠]作源圖，博以不草加抑腔制劑剖的為予控制栽線。營(yíng)2聲結(jié)果奧與討謊論劉2.吼1循吲哚圈喹啉宵生物忍堿衍疲生物勸對(duì)螺AC俘h踐E蘋(píng)的抑反制活供性旗表1蚊吲欣哚喹且啉衍新生物維對(duì)A琴Ch括E喪的抑漲制I昆C嫂50溪值威C贈(zèng)om憂po統(tǒng)un失d煙X代n柄R玩IC常50尾(含M慚)躺pH折=7忽pH啦=8墓19弦a玩NH拼2容N(笑CH夾3詳)牙2桌38麗42衡19梅b愈O折2贏N(包CH嗓3研)捐2下73洞89判.5貿(mào)19此c余NH縮3拾N(疑CH蹦3東)爺2率4.鋪8幫41尿.5帥19候d認(rèn)O尖3填N(文CH跌3咐)則2續(xù)57搜68史19往e魂N過(guò)H杰2第23槐.7朋29幸19畢f(xié)旬O瘦2斑20畏22恨19遵g誼NH袖2輝OH遙21殲30辜19配h醉O貪2番OH蹤53旅76慌.5驚Co溝mp雖ou罰nd復(fù)X珠n嘆R禾IC獲50套(至M趣)延pH齒=7按pH永=8究19當(dāng)i袍NH懲--羊--肢--樸--允46澆23齡5忌19殖j沖O獎(jiǎng)--鴉--置--群--淹58粥16流3齡從他衣克林洞等化幼合物乒的結(jié)冷構(gòu)可雞以看兇出，汽它是駛一種灰喹啉臂衍生鳳物，煌具有詢(xún)?nèi)h(huán)別結(jié)構(gòu)歲，而氧我們膊所合葵成的螞吲哚外喹啉酒衍生匙物在武結(jié)構(gòu)騎上與息他可槍林有證許多啊相似段之處續(xù)，為鐘此我浩們研棕究了爭(zhēng)它們青對(duì)乙森酰膽井堿酯薪酶的急抑制襪活性側(cè)，結(jié)歇果見(jiàn)俊表1本。邀實(shí)驗(yàn)本結(jié)果壇表明仍，吲誘哚喹滾啉類(lèi)灣衍生增物（姥19刻a-痰19踩j）值對(duì)乙朵酰膽經(jīng)堿酯線酶均賓有明奪顯的字抑制離作用帽，化隆合物傅19穩(wěn)c的導(dǎo)抑制舅效果朗最好軌(司IC佩50杰=4壺.8野M汁)編。五首元環(huán)扁上X博原子杠為N押H的題抑制胖效果租比O撐好，莖原因片是N戒H可裝增加梁環(huán)的娃共軛揚(yáng)性，椅使四喬個(gè)環(huán)謊在一葛個(gè)平就面上緊；而敢O使稅環(huán)面敬不在坊同一雄個(gè)平查面上舟，增壟加了芬空間嚷位阻然，對(duì)魔酶的閉抑制繳作用逼降低釀?；瘹W合物享19獲c比校19學(xué)a側(cè)捷鏈上千多了袖一個(gè)簡(jiǎn)碳原貌子，撈抑制憲酶效授果增鋪強(qiáng)，晨說(shuō)明膜碳鏈嫂的長(zhǎng)患短對(duì)煉抑制賀活性回起作扇用。到另外代，抑陰制劑岸側(cè)鏈已上有氏親脂歇性的銅陽(yáng)離預(yù)子頭考能更課好的皆被酶稿的作柱用位啄點(diǎn)吸通附而純較好弟地抑物制酶膊的活鼠性，劃化合說(shuō)物1販9b躍，1縣9e分的抑盛制活嶄性都墓沒(méi)有它19胡c好脹可能勁是由搏于1沒(méi)9b傭的羥船基不毅易以貨正離斃子形擱式存去在，對(duì)而1嫁9e飾苯酚氏不是惕脂肪脂族側(cè)絨鏈，振且位漿阻較凡大，濃也沒(méi)融有陽(yáng)買(mǎi)離子征頭，欄較難叼產(chǎn)生避抑制承作用豎。此罰外，漁該系勵(lì)列化逝合物蓄的p久K運(yùn)a板值都更在8遣左右愿。p爬H＝輕7時(shí)蓬化合礦物以算鹽的猾形式賞存在芹，環(huán)嘗上的傘N帶孫正電唉荷；碼pH匹=8男時(shí)化攏合物刊沒(méi)有艦成鹽便，不晌能很催好抑禍制酶幻的活留性。潑可以幣看到減上表汗中所系有化護(hù)合物蛙都在逮pH各＝7膨的酸片堿體棉系中快有更余好的才抑制踢效果接。野由以塌上討臣論，泊我們屬可得者出以華下幾缺個(gè)影挺響抑慚制劑指抑制恥活性月的因娛素：掀（1惜）分貼子中繡心存瓜在一發(fā)個(gè)吲訓(xùn)哚喹印啉的過(guò)共軛武環(huán)；液（2犁）側(cè)年鏈上枕存在維一個(gè)陸親脂份性陽(yáng)艇離子滴頭；猴（3蹈）脂截肪族萌側(cè)鏈敵大于礎(chǔ)兩個(gè)樸C原辜子；盛（4鄰）合罰適的遼體系初pH個(gè)值?？?.妖2辛中藥魄有效逃成分廉（化即合物興1-層18邀）對(duì)句A竭Ch茶E煮的活姿性抑吳制莫由表公2可秘以看暗出，牽五環(huán)相三萜抱類(lèi)化僅合物步4服、釀5錯(cuò)、填6恒和眠7旬具有威較好移的活戒性，臨與這秒些化槽合物陵的大班分子蘋(píng)結(jié)構(gòu)窮有關(guān)甜，其快中化槽合物篇5的逆抑制柳活性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