花生品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法

花生品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simplesequencerepeat，SSR）標(biāo)記法進(jìn)行花生（ArachishypogaeaL.）品種鑒定的術(shù)語與定義、儀器設(shè)備、試劑與溶液配制、引物信息、鑒定方法、數(shù)據(jù)讀取與判定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于花生品種的鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19557.1植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南總則NY/T2237植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南花生術(shù)語與定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。簡(jiǎn)單重復(fù)序列simplesequencerepeat，SSR由幾個(gè)核苷酸（1～6個(gè)）為重復(fù)單位聚集而成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)至幾百個(gè)bp（一般為100～200）的串聯(lián)重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星序列或短串聯(lián)重復(fù)序列，其多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。推薦引物recommendedprimer根據(jù)最少引物區(qū)分最多品種的原則篩選出的一套SSR引物，具有條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好、均勻分布的特點(diǎn)，用于DNA分子數(shù)據(jù)的采集和品種鑒定。參照品種referencevariety具有推薦SSR位點(diǎn)上不同等位變異的花生品種，用于輔助確定送檢樣品的等位變異擴(kuò)增片段的大小，校正儀器設(shè)備的系統(tǒng)誤差。儀器設(shè)備所用儀器設(shè)備見附錄A。試劑、溶液配制及引物信息試劑及溶液配制試劑及溶液配制見附錄B（除特殊說明外，所用試劑均為分析純）。引物信息推薦引物的相關(guān)信息見附錄C。鑒定方法樣品準(zhǔn)備樣品為花生種子及其他植物組織。種子樣品的分樣和保存，按照GB/T3543.2的規(guī)定執(zhí)行。每份樣品中至少隨機(jī)抽取10個(gè)個(gè)體，每個(gè)個(gè)體單獨(dú)分析。如樣品為種子，水培法種植，至第三片真葉長(zhǎng)出后備用。參照品種（見附錄D）各種植2粒，混合分析。樣品的DNA提取DNA提取取花生幼嫩組織50mg，放入組織破碎儀中，液氮研磨。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取基因組DNA，室溫風(fēng)干，加入100μL1×TE（pH8.0）溶液溶解DNA。完全溶解后每管加入5μLRNAase，37℃溫育1h，－20℃下保存留用。DNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)利用0.8%X脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，GoldView染料進(jìn)行染色。測(cè)定DNA溶液的OD260/OD280值，在1.8～2.0范圍內(nèi)最佳。測(cè)定其OD260的吸光度，以1個(gè)OD260值相當(dāng)于50mg/LDNA濃度來計(jì)算DNA的濃度。稀釋至工作濃度為30ng/μL，置于4℃下備用。PCR擴(kuò)增參照品種的使用在進(jìn)行PCR擴(kuò)增和等位基因檢測(cè)時(shí)，不同SSR引物的參照品種參見附錄C。反應(yīng)體系總體系為10μL，包括4.5ng/μLDNA，0.8μmol/LF/R引物，1×DreamTaqGreenPCRMasterMix，1.9μL蒸餾水，混勻。反應(yīng)程序95℃預(yù)變性3min；95℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；4℃下保存?zhèn)溆谩CR產(chǎn)物檢測(cè)玻璃板組裝清洗玻璃板和樣品梳，晾干。用無水乙醇擦拭凹板和平板各2遍，待玻璃板徹底干燥后，將1.0mm厚的塑料邊條整齊擺放在平板兩側(cè)，蓋上凹板，對(duì)齊，夾緊，用水平儀調(diào)平。制膠根據(jù)凝膠的面積和數(shù)量，調(diào)整6%聚丙烯酰胺凝膠溶液的用量，分別加入1‰的APS和1‰的TEMED，輕輕搖勻，防止產(chǎn)生氣泡，迅速灌膠。待膠液充滿玻璃板夾層，在上部凹面處輕輕插入樣品梳平端，深度約0.8cm。室溫下靜置1h，使膠液聚合，如室溫較低可適當(dāng)XX聚合時(shí)間。電泳準(zhǔn)備將制好的膠板固定于垂直電泳槽上，凹板向內(nèi)。上下槽中各加入1×TBE緩沖液，至下槽液面約為槽高的1/3，上槽液面高于玻璃板凹面約1cm。拔去梳子，沖洗膠孔，清除底層氣泡和雜質(zhì)。將樣品梳齒端插入凝膠1mm～2mm處。上樣PCR產(chǎn)物中加入1/6體積的6×loadingbuffer，微量移液器上樣，每孔加入2μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物（上樣量可根據(jù)加樣孔的大小適當(dāng)調(diào)整）。20bpDNALadder分子量標(biāo)記加入兩側(cè)加樣孔中，對(duì)應(yīng)參照品種的PCR產(chǎn)物加入中間加樣孔中，檢測(cè)樣品PCR產(chǎn)物加入其余加樣孔中。電泳電壓為200V，根據(jù)指示劑位置調(diào)整時(shí)間，至青藍(lán)色的二甲苯青指示帶到達(dá)膠板底部，停止電泳，電泳時(shí)間一般為2h。銀染顯色水洗電泳結(jié)束后，分開兩塊玻璃板，取出凝膠，用蒸餾水快速漂洗2次，不超過10s。銀染將凝膠轉(zhuǎn)移至適量染色液中，使其完全浸沒，在搖床上輕搖10min。水洗將凝膠從染色液中取出，在蒸餾水中快速漂洗2次，時(shí)長(zhǎng)8s～10s。顯影將凝膠轉(zhuǎn)移至適量顯色液中，使其完全浸沒，在搖床上輕搖至帶紋清晰。漂洗將凝膠轉(zhuǎn)移到蒸餾水中清洗，直至蒸餾水澄清。成像將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)的工作臺(tái)上，選用透射紫外光觀察，調(diào)節(jié)至圖像最清晰，保存。數(shù)據(jù)讀取與判定方法數(shù)據(jù)讀取利用凝膠分析軟件Quantityone讀取條帶，每個(gè)SSR位點(diǎn)的等位變異大小用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度表示，單位為bp。與對(duì)應(yīng)的參照品種進(jìn)行比較，校正系統(tǒng)誤差，確定送檢樣品在每個(gè)位點(diǎn)的等位變異大小，獲得送檢樣品27個(gè)SSR位點(diǎn)的指紋圖譜。判定方法根據(jù)送檢樣品與相應(yīng)品種指紋圖譜的差異位點(diǎn)數(shù)，對(duì)送檢樣品進(jìn)行鑒定。當(dāng)送檢樣品與相應(yīng)品種指紋圖譜的差異位點(diǎn)數(shù)≥2，則判定為“不同品種”；當(dāng)差異位點(diǎn)數(shù)=1，判定為“近似品種”；當(dāng)差異位點(diǎn)數(shù)=0，判定為“疑同品種”。對(duì)于差異位點(diǎn)數(shù)≤1個(gè)的送檢樣品，應(yīng)按GB/T19557.1給出的原則和NY/T2237給出的方法進(jìn)行田間測(cè)試，確定送檢樣品在表型性狀上是否與對(duì)應(yīng)品種一致。

（規(guī)范性附錄）

儀器設(shè)備組織破碎儀溫控范圍為－40℃～室溫。高壓滅菌鍋滅菌溫度為105℃～136℃，最大工作壓力為0.22MPa。凝膠成像系統(tǒng)分辨率不低于400百萬像素。高速冷凍離心機(jī)最大離心力不小于15000g。PCR擴(kuò)增儀控溫范圍為0℃～100℃。紫外可見分光光度計(jì)波長(zhǎng)范圍為190nm～1100nm。恒溫水浴鍋溫度范圍為室溫～99℃。水平搖床轉(zhuǎn)速為0rpm～230rpm。微波爐最高耐溫120℃。電子天平精確到0.01g。電泳槽樣品通量為1.0mm厚。磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為0r/min～2500r/min，控溫范圍為室溫～100℃。酸度計(jì)測(cè)量范圍為0.00pH～14.00pH。微量移液器量程分別為2μL、10μL、100μL、200μL、500μL和1000μL。

（規(guī)范性附錄）

試劑及溶液配制試劑乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）。三羥基甲基氨基甲烷（Tris）。鹽酸（HCl，36%）。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）。氯化鈉（NaCl）。硼酸（Borate）。丙烯酰胺。甲叉雙丙烯酰胺。四甲基乙二胺（TEMED）。無水乙醇。過硫酸銨（APS）。硝酸銀（AgNO3）。X脂糖。6×loadingbuffer。GoldView染料。RNAase（10mg/mL）。酚:氯仿:異戊醇（體積比25:24:1）。異丙醇。四硼酸鈉。甲醛。2×DreamTaqGreenPCRMasterMix。SSR引物（10μmol/L）。20bpDNALadder。重蒸水或符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水.溶液配制1mol/LNaOH4gNaOH，加蒸餾水定容至100mL。1mol/LTris-Cl（pH8.0）溶液稱取121.1gTris，加蒸餾水定容至1L，濃鹽酸調(diào)至pH8.0，高壓滅菌備用。0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液稱取186.1gEDTA-Na2，800mL蒸餾水，加熱定容至1L，1mol/LNaOH調(diào)至pH8.0，高壓滅菌備用。1×TE1mL1mol/LTris-HCl（pH8.0），0.2mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加蒸餾水定容至100mL。DNA提取液4gCTAB，16.364gNaCl，20mL1mol/LTris-Cl（pH8.0），8mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加蒸餾水定容至200mL，4℃條件下保存。使用前加入2%的巰基乙醇，實(shí)驗(yàn)前預(yù)熱至65℃。70%乙醇700mL無水乙醇，加蒸餾水定容至1L。10×TBE緩沖液分別稱取108g三羥基氨基甲烷，55g硼酸，加入800mL蒸餾水加熱溶解，再加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液37mL，加蒸餾水定容至1L。1×TBE緩沖液100mL10×TBE，加蒸餾水定容至1L。10%APS0.5gAPS溶于5mL蒸餾水中。6%聚丙烯酰胺凝膠溶液（29:1）分別稱取58g丙烯酰胺，2g甲叉雙丙烯酰胺，100mL10×TBE，加蒸餾水定容至1L，4℃條件下保存。染色液稱取1g硝酸銀，加蒸餾水定容至1L。顯色液6gNaOH，0.2g四硼酸鈉，1.6mL甲醛，加蒸餾水定容至400mL。

（資料性附錄）

推薦引物推薦引物見表C.1。推薦引物引物連鎖群引物序列（5′→3′）常見等位變異（bp）參照品種Ah1TC5A06A07F-tcggtttgggagacactcttR-ttgtaagcagacgccacatc160zh.h2461162zh.h5075164166zh.h2406zh.h1961168zh.h0949172zh.h2250176zh.h2405180zh.h2764188zh.h0537Ah2TC11H06B04F-ccatgtgaggtatcagtaaagaaaggR-ccaccaacaacattggatgaat168zh.h2413174zh.h2499182zh.h5399198zh.h0930202zh.h2405206zh.h2764210zh.h4749Ah3TC23C08B06F-agcagagtggaaaacgaagaagR-gtcagtttgtgaatcgggtttt89zh.h474991zh.h503493zh.h240699zh.h0861101zh.h1797103zh.h1585AHGS0138B10F-catattgacggtgatggcagR-ccgaccctaatcctaatacaaca150zh.h5060154zh.h2462162zh.h2405164zh.h2682168zh.h5034174zh.h2069表C.1推薦引物（續(xù)）引物連鎖群引物序列（5′→3′）常見等位變異（bp）參照品種AHGS0151A05F-agcaaatgaaggtgagggtgR-gcccaaaaatgctaacgaag65zh.h233068zh.h241390zh.h2250108zh.h2405112zh.h2591115zh.h5075118zh.h5034AHGS0599未定位F-agattggtggtgacagaggcR-gccatcgatgtaaccctcac233zh.h0949236zh.h5399253zh.h2250260zh.h0525263zh.h2405266zh.h2466GM1843未定位F-cccacacacacacacacactaR-aggtgatgctgcgtttcttt66zh.h223174zh.h158582zh.h053186zh.h225090zh.h260894zh.h2462GM1996B03F-catcccatcattttccctcttR-tacagtgaaggtgggatcctg77zh.h503485zh.h532787zh.h139589zh.h276492zh.h2405GM2638A04F-atgctctcagttcttgcctgaR-cagacataacagtcagtttcacc45zh.h168955zh.h270257zh.h238463zh.h474965zh.h532769zh.h225073zh.h0949GNB357未定位F-aggtttgctttgggatgatgR-ccgataaaaccaggcaagaa191zh.h5034194zh.h1602197zh.h2406203zh.h0537215zh.h0861218zh.h1331表C.1推薦引物（續(xù)）引物連鎖群引物序列（5′→3′）常見等位變異（bp）參照品種GNB317未定位F-gaaaagcttgcaaaatcgagaR-tccttccatgttggtgaatg188zh.h2550194zh.h0540197zh.h2561200zh.h2405203zh.h2764212zh.h5034224zh.h2462227zh.h0537230zh.h4749GNB556A01F-tcagggtgggttaccaacatR-taatccacattgaaccgacg56zh.h052562zh.h093468zh.h241371zh.h241077zh.h086880zh.h223186zh.h1331PM308未定位F-ccttcttctttctcctcctcaR-caattcgtgatagtattttattggaca64zh.h503474zh.h474978zh.h097780zh.h276482zh.h246486zh.h240592zh.h0680pPGSseq19D6B05F-tttgttatgctcacaccccaR-aaaaatgaagcaatattttgttgttag180zh.h4779192zh.h2406200zh.h2508204zh.h0537210zh.h5034pPGPseq2C11A03F-tgacctcaattttggggaagR-gccactattcatcgcggta385zh.h2456403zh.h2764418zh.h4749439zh.h2405450zh.h2406461zh.h0436Ah2TC7C06A06F-ggcaggggaataaaactactaactR-ttttccttccttctcctttgtc130zh.h2405134zh.h2764142zh.h2413144zh.h5098146zh.h2250表C.1推薦引物（續(xù)）引物連鎖群引物序列（5′→3′）常見等位變異（bp）參照品種Ah3TC20B05A08F-gcatgtaaactatgcaatcgctR-caacaacttattccaccaaatatca64zh.h503472zh.h240676zh.h246284zh.h532786zh.h0861Ah590B03F-caaaacgcaatgcaaggtacgR-acgaacgtgcagcaagaagaag144zh.h5060162zh.h0949180zh.h2405190zh.h0764194zh.h2250200zh.h0977AHS2037A10F-tggccttgattactctcgctR-acaggggtctggaggaagtt312zh.h2405318zh.h1315321zh.h4749327zh.h5034342zh.h5075Ai119F10B05F-tggcaattgattagagattagaR-cagaagaggtgggagaga222zh.h2405226234238254zh.h1602zh.h4749zh.h0537zh.h0099GNB320未定位F-gaattcctggctcgaacttgR-acccctccatttcgtcttct332zh.h2462334zh.h2177336zh.h4749342zh.h0977GNB329未定位F-ccctttttcgctttcttcctR-gttctcgtttgtgccctctc208zh.h2764211zh.h0977217zh.h2405223zh.h5060238zh.h1315PM210B06F-ccgcagatcttctcctgtgtR-cctcctcatcctctaaactctgc179zh.h2208183zh.h2562187zh.h2425193zh.h5030196zh.h5365201zh.h2426表C.1推薦引物（續(xù)）引物連鎖群引物序列（5′→3′）常見等位變異（bp）參照品種IPAHM23B08F-gtgtcttttcgttcgcgattR-cgactcttagggtggattatagtaaga59zh.h240574zh.h246277zh.h2069PM358A07F-ccacaaacagtgcagcaatcR-tcaaaggccatttcatcaca138zh.h1816141zh.h2561143zh.h2413149zh.h4673PM375未定位F-cggcaacagttttgatggttR-gaaaaatatgccgccgttg100zh.h4749110zh.h0861150zh.h2406152zh.h2076pPGPseq2D12BB02F-aagctgaacgaactcaaggcR-tgcaatgggtacaatgctaga288zh.h2764294zh.h0102300zh.h2405318zh.h0537330zh.h0678

（資料性附錄）

參照品種名單參照品種名單見表D.1參照品種名單序號(hào)種質(zhì)庫統(tǒng)一編號(hào)品種名稱序號(hào)種質(zhì)庫統(tǒng)一編號(hào)品種名稱1zh.h0099XX小站秧34zh.h2384XX白沙雞豆仔2zh.h0102XX赤豆花生35zh.h2405試花1號(hào)3zh.h0436蒲廟花生36zh.h2406試花3號(hào)4zh.h0525錦交1號(hào)37zh.h2410博山站秧子5zh.h0531滕縣滕子花生38zh.h2413XX小麻葉6zh.h0537XX小花生39zh.h2425X