基礎(chǔ)免疫檢測(cè)培訓(xùn)

標(biāo)記免疫分析免疫基礎(chǔ)一、免疫的概念免疫學(xué)（immunology）是研究機(jī)體自我識(shí)別和對(duì)抗原性異物排斥反應(yīng)的一門(mén)科學(xué)。二、免疫測(cè)定利用抗原體反應(yīng)來(lái)測(cè)定標(biāo)本中微量物質(zhì)的方法稱為免疫測(cè)定(immunoassay)。三、免疫測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)免疫測(cè)定具有高度的特異性和敏感性標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)抗原

抗原(antigen，Ag)是指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并能與應(yīng)答產(chǎn)生如抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異反應(yīng)的物質(zhì)。一個(gè)完整的抗原應(yīng)包括兩方面的免疫性能：①免疫原性(immunogenicity)指誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種能力的物質(zhì)稱為免疫原(immunogen)；②免疫反應(yīng)性(immunoreactivity)指抗原與抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的能力，亦稱為反應(yīng)原性。抗體抗體(antibody)：機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。抗體的功能：與抗原(包括外來(lái)的和自身的)相結(jié)合，從而有效地清除侵入機(jī)體內(nèi)的微生物、寄生蟲(chóng)等異物，中和它們所釋放的毒素或清除某些自身抗原，使機(jī)體保持正常平衡，但有時(shí)也會(huì)對(duì)機(jī)體造成病理性損害，如抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體等一些自身抗體的產(chǎn)生，對(duì)人體可造成危害。

免疫測(cè)定的基礎(chǔ)抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)（antigen-antibodyreaction）是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的特性（一）特異性抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上是抗原表位與抗體超變區(qū)中抗原結(jié)合點(diǎn)之間的結(jié)合。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原與抗體的結(jié)合具有高度的特異性。這種特異性如同鑰匙和鎖的關(guān)系。（二）按比例在抗原抗體特異性反應(yīng)時(shí)，生成結(jié)合物的量與反應(yīng)物的濃度有關(guān)。（三）可逆性抗原抗體復(fù)合物解離取決于兩方面的因素，一是抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親和力；二是環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響。免疫測(cè)定技術(shù)免疫比濁技術(shù)金標(biāo)免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)放射免疫分析熒光免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)免疫比濁技術(shù)免疫濁度技術(shù)是利用可溶性抗原、抗體在液相中特異結(jié)合，形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過(guò)剩時(shí)，形成的復(fù)合物隨抗原量增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，即可計(jì)算出樣品的含量散射比濁與投射比濁RADIOMETERPRESENTATION1007/06/2023乳膠技術(shù)RADIOMETERPRESENTATION1107/06/2023通過(guò)乳液聚合作用優(yōu)化聚苯乙烯核心的大小(260nm)核心表面上覆蓋著富含化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)的薄層，抗體通過(guò)氨基和自由醛基的聯(lián)接特異地共價(jià)結(jié)合到顆粒上聚苯乙烯核心富含反應(yīng)基團(tuán)的外殼抗體如:CRP靈敏度提高了10倍影響因素RADIOMETERPRESENTATION1207/06/2023

由于免疫比濁法的特性，光散射性顆粒仍然會(huì)對(duì)其產(chǎn)生干擾：脂蛋白纖維蛋白血清或血漿中的冷凝蛋白質(zhì)尿液中的細(xì)胞和結(jié)晶腦脊液中的細(xì)胞比濁法特點(diǎn)典型代表機(jī)型：生化儀，血凝儀，特定蛋白分析儀靈敏度：mg/ml抗原過(guò)量的影響RADIOMETERPRESENTATION1307/06/2023金標(biāo)免疫技術(shù)金標(biāo)法就是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是氯金酸的水溶液在還原劑作用下聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，膠體金與蛋白質(zhì)之間形成非共價(jià)鍵的靜電吸引而牢固結(jié)合，對(duì)所標(biāo)記的蛋白生物活性沒(méi)有明顯影響。金標(biāo)免疫技術(shù)以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細(xì)血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，通過(guò)抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色（紅色）反應(yīng)，檢測(cè)抗原/抗體。RADIOMETERPRESENTATION1607/06/2023典型代表機(jī)型：POCT儀器優(yōu)點(diǎn)：試劑成本低，檢測(cè)速度快缺點(diǎn)：定性檢測(cè)為主，定量檢測(cè)精度差。試劑穩(wěn)定性較差，常作為過(guò)篩試驗(yàn)用金標(biāo)免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免技術(shù)

酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定異相酶免疫測(cè)定ELISA固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)(一)基本原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗體的形成）在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)）用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。（酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物的分離）加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。（顯色反應(yīng)）ELISA主要組分酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)

辣根過(guò)氧化物酶（HRP）鄰苯二胺（OPD）

四甲替聯(lián)苯胺(TMB)

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶(AP)

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

酶和底物1．雙抗體夾心法2．間接法3.競(jìng)爭(zhēng)法ELISA視頻RADIOMETERPRESENTATION2507/06/2023洗滌：

決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。目的：洗去反應(yīng)液中沒(méi)有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種。酶免ELISA操作麻煩影響因素多傳染病篩查血站RADIOMETERPRESENTATION2707/06/2023放射免疫分析放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫分析法，用于定量測(cè)定受檢標(biāo)本中的抗原。最初建立的方法模式是以核素標(biāo)記的抗原與受檢標(biāo)本中抗原競(jìng)爭(zhēng)的測(cè)定模式，為區(qū)別于前者，稱為免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）。兩種方法均在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用。放射免疫分析放射免疫分析由于敏感度高、特異性強(qiáng)、精密度高、并可測(cè)定小分子量和大分子量物質(zhì)，所以在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用極為廣泛。但由于核素的放射性對(duì)人體有一定的危害性，必須加以防護(hù)，核素實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)須經(jīng)防疫部門(mén)的監(jiān)督，操作人員須經(jīng)過(guò)特殊訓(xùn)練。另外由于核素有半衰期，試劑盒的貨存期較短，因而放射免疫分析在應(yīng)用中有諸多不便之處。從長(zhǎng)遠(yuǎn)前景看，放射免疫分析有被取代的趨勢(shì)。發(fā)光免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)是將發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，以檢測(cè)抗原或抗體的方法。其既具有免疫反應(yīng)的特異性，更兼有發(fā)光反應(yīng)的高敏感性，在免疫學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用日趨廣泛。發(fā)光免疫分為：1、光照發(fā)光（photoluminescence）2、生物發(fā)光（bioluminescence）3、化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射?；瘜W(xué)發(fā)光是一個(gè)多步驟的過(guò)程，其機(jī)制為某些化合物（發(fā)光劑或發(fā)光底物）可以利用一個(gè)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）?；瘜W(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光免疫分析法以標(biāo)記方法的不同而分為兩種:(1)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析法.(2)酶標(biāo)記、以化學(xué)發(fā)光底物作信號(hào)試劑的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法.發(fā)光YYY磁微粒被測(cè)抗原+抗體+帶丫啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后---夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點(diǎn)抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分的易分離磁微粒技術(shù)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析法代表公司：雅培，西門(mén)子經(jīng)典機(jī)型：Architecti2000/1000，ADVIACentaur

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescenceenzyme

immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。二、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析該分析系統(tǒng)采用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。㈠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法代表公司：強(qiáng)生經(jīng)典機(jī)型：VitrosECi該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。

二、堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖

二、堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法代表公司：庫(kù)爾特貝克曼，西門(mén)子經(jīng)典機(jī)型：AccessAccess2，Immulite1000/2000電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，

ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體，在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。

電化學(xué)發(fā)光免疫分析在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，在反應(yīng)體系內(nèi)待測(cè)標(biāo)本與相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體-待測(cè)抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室，同時(shí)引人TPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度成正比。電化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖電化學(xué)發(fā)光示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖標(biāo)記磁顆粒在電場(chǎng)中發(fā)光工作示意圖RADIOMETERPRESENTATION4707/06/2023電化學(xué)發(fā)光視頻電化學(xué)發(fā)光代表公司：羅氏經(jīng)典機(jī)型：2010,1010，E170，e601，e602Elecsys2010系統(tǒng)瀏覽系統(tǒng)控制中心樣品轉(zhuǎn)盤(pán)樣品和試劑探針試劑攪拌棒蒸溜水液體廢物固體廢物反應(yīng)管和Tip頭TPA和洗液檢測(cè)系統(tǒng)機(jī)械抓手探針試劑轉(zhuǎn)盤(pán)Elecsys2010系統(tǒng)瀏覽內(nèi)置樣品盤(pán)外置樣品盤(pán)E170的模式圖D2400Module至2400test/hr生化16光通道用BM/Hitachi試劑分配技術(shù)P800Module

至800

test/hr生化至44通道用BM/Hitachi試劑分配技術(shù)ISE900/1800Module900or1800testNa+,Cl+,K+緩沖液進(jìn)入:2trays300樣本持續(xù)進(jìn)入架子做STAT端自動(dòng)重測(cè)和反射重測(cè).緩沖液進(jìn)入下載300樣本用2trays.

持續(xù)樣本架下載自動(dòng)重測(cè)和反射重測(cè).控制中心:

WindowsNT觸摸/鼠標(biāo)操控遠(yuǎn)程診斷E170ModuleE170的模式圖(軌道)1.急診樣品插入點(diǎn)2.樣品輸入3.主軌道4.每個(gè)模塊的運(yùn)行軌道5.分樣位置6.樣品重運(yùn)行7.樣品輸出8.重運(yùn)行軌道Elecsys的弱點(diǎn)流動(dòng)讀數(shù)池—高攜帶率PMT和電極—壽命短(10萬(wàn)次),費(fèi)用高磁性顆?！戎乇人?試劑不均勻沖洗方式—表面被動(dòng)沖洗,如酶標(biāo)板,有殘留蒸溜水探針清洗—高攜帶率試劑混勻—攪拌棒,有攜帶一次清洗—Hook效應(yīng)質(zhì)控—只控制低值或中值區(qū)域放射免疫法ＲＩＡ興起于20世紀(jì)60年代，產(chǎn)品生命周期已終結(jié)；

酶聯(lián)免疫法ＥＬＩＳＡ

興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍在臨床應(yīng)用；產(chǎn)品處于衰退期；

化學(xué)發(fā)光免疫法ＣＬＩＡ興起于20世紀(jì)80年代，已被臨床普遍使用；產(chǎn)品處于成熟期方法學(xué)進(jìn)展酶標(biāo)熒光放免發(fā)光靈敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9靈敏度酶標(biāo)熒光放免發(fā)光線性范圍105104103102線性范圍酶標(biāo)熒光放免發(fā)光有效期（月）1815129630有效期檢測(cè)靈敏度免疫檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度酶免檢測(cè)10-9mol/L放射免疫測(cè)定10-12mol/L熒光免疫測(cè)定10-12mol/L化學(xué)發(fā)光測(cè)定10-15mol/L電化學(xué)發(fā)光測(cè)定10-17mol/L時(shí)間分辨免疫測(cè)定10-18mol/L例如：電化學(xué)發(fā)光TSH檢測(cè)試劑的分析靈敏度為0.005mIU/L

第四代化學(xué)發(fā)光TSH檢測(cè)試劑的分析靈敏度為0.001mIU/L

原因在于抗體的親合力，而不是檢測(cè)技術(shù)。篩選抗體、屏蔽干擾，生產(chǎn)工藝、管理水平和技術(shù)服務(wù)是試劑生產(chǎn)的關(guān)鍵這些發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的靈敏度及線性范圍都已經(jīng)接近了免疫反應(yīng)的極限。靈敏度的瓶頸在于抗體親合力和干擾免疫反應(yīng)的因素，而不是檢測(cè)技術(shù)片面宣揚(yáng)檢測(cè)技術(shù)靈敏度和線性范圍的強(qiáng)弱，不僅毫無(wú)意義，而且也是荒謬的。需要注意的問(wèn)題??！什么是免疫分析？RADIOMETERPRESENTATION6007/06/2023抗體：捕獲抗體，標(biāo)記抗體/示蹤抗體標(biāo)記物：酶，發(fā)光基團(tuán)，金顆粒底物：OPD,TMB,魯米諾，AMPPD等抗原：待測(cè)樣本包被載體：ELISA板，磁珠，微球，NC膜免疫分析：