DB13T 5688-2023 蜜蜂微孢子蟲病綠色防治技術規(guī)程

ICS65.020CCSB1613河 北 省 地 方 標 準DB13/T5688—2023蜜蜂微孢子蟲病綠色防治技術規(guī)程2023-05-06發(fā)布 2023-06-06實施河北省場監(jiān)督理局 發(fā)布DB13/T5688—2023DB13/T5688—2023DB13/T5688—2023DB13/T5688—2023前 言本文按GB/T1.1—2020《標化作則 第部分標化件結和起規(guī)定起。本文件由河北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。II蜜蜂微孢子蟲病綠色防治技術規(guī)程范圍要求。本文件適用于蜜蜂微孢子蟲病癥狀、形態(tài)及分子生物學診斷和綜合防治。（）GB/T19168蜜蜂病蟲害綜合防治規(guī)范SN/T1683蜜蜂微孢子蟲病診斷方法OIE陸生動物衛(wèi)生法典下列術語和定義適用于本文件。3.1蜜蜂微孢子蟲是一種侵染成年蜜蜂中腸上皮細胞引起蜜蜂發(fā)病的致病性真菌，包括蜜蜂微孢子蟲和東方蜜蜂微孢子蟲2個種。3.2消毒[來源：OIE陸生動物衛(wèi)生法典，有修改]。3.3監(jiān)測指系統(tǒng)而持續(xù)地收集、整理和分析與蜜蜂微孢子蟲病有關的信息，并及時向相關人士傳遞信息以便采取相應的措施。[來源：OIE陸生動物衛(wèi)生法典，有修改]。蜜蜂微孢子蟲病綠色防治技術流程圖(如圖1)：3圖1 蜜微子病防治術程圖PCR癥狀當蜂群感染處于后期重癥階段時有如下癥狀：0.5cm4除了部分成年蜜蜂在蜂箱外爬行外，沒有其他異常表現(xiàn)。蜜蜂個體感染病原后可通過如下癥狀進行初步判斷。將采集的蜜蜂樣本，分離腹部置于研缽中，加入5mL～10mL蒸餾水研磨。取研磨的組織涂片，在明場或相差光學顯微鏡下以400～600倍進行檢查。鑒定初診5μm～73μm～4鑒別按SN/T1683相關方法與酵母、真菌孢子、脂肪體或馬氏管變形蟲囊包進行鑒別。PCRDNA提取緩沖液配方見表1：表1 DNA取沖配方試劑名稱濃度CTAB0.03MTris0.05MEDTA0.01MNaCl1.1M注：緩沖液最終用ddH2O將pH值調至8.0操作步驟如下：（mL300μL4μL20mg/mLK603h（300μL）1113000rpm15min1:112600μL9530μL3mol/LNaOAc-20夜；10000rpm15min1mL7010min30μLddH2O6510min10000rpm10sDNA；DNA-205標引序號說明:A—中腸；B—小腸；C—后腸；D—蟄針。圖2蜜蜂中腸取樣部位PCRDNA5PCRA.115μLPCRPCRa) 94℃2.5min；b) 9415s，61.830s，7245s36727min；擴增產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離，GoldView染色，照膠。通過以下凝膠中電泳條帶的位置可最終判別蜜蜂是否感染微孢子蟲病原及種類：115bp218bp321bp取樣為保證所采集的樣品具有代表性，應按以下標準確定樣品數(shù)量。50（）120～3050320～30不同的取樣目的應分別遵循如下方法采集樣品。1常溫、干燥保存于紙盒內(nèi)。防控養(yǎng)蜂場場址按GB/T191683.1蜂場場址的選擇給出的要求進行選擇。6飼料春繁期飼喂蜂蜜花粉時，不使用來歷不明的花粉，飼喂前應對花粉進行不少于20min的蒸汽消毒。2%～3%氫氧30min50mL4監(jiān)測每年從去除越冬包裝開始，直至下次越冬包裝前，應至少每3個月對蜂群進行1次蜜蜂微孢子蟲病的病原監(jiān)測，定量調查蜂群受感染程度。根據(jù)上兩個年度的監(jiān)測記錄及當前監(jiān)測結果隨時調整本年度的防控措施。防治預防1g1000g7治療當蜂群出現(xiàn)大量因排泄不暢的爬蜂時，取4g大黃蘇打片，溶于1000mL濃度為1:1100mL17附錄A（規(guī)范性）PCR反應體系及引物序列PCR表A.1 PCR應系劑比試劑劑量（μL）濃度5×PCRbuffer3引物610μMOneTaq聚合酶0.25U/μLdNTPs0.510mMDNA模板2ddH2O3.3注1：3對引物的正負引物各1μL注2：反應體系15μL表A.2 引物列擴產(chǎn)信息病原名稱ForwardPrimerReversePrimer產(chǎn)物大小（bp）東方蜜蜂微孢子蟲（NosemaCeranae）CGGCGACGATGTGATATGAAAATATTAACCCGGTCATTCTCAAACAAAAAACCG218蜜蜂微孢子蟲（NosemaApis）GGGGGCATGTCTTTGACGTA