生物化學(xué)蛋白質(zhì)-課件

第三部分氨基酸和蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位——氨基酸蛋白質(zhì)和多肽的肽鍵可被催化水解酸/堿能將蛋白完全水解，得到各種AA的混合物酶水解一般是部分水解，得到多肽片段和AA的混合物地球上天然形成的AA300種以上。構(gòu)成蛋白質(zhì)的AA只有20余種，且都是α-氨基酸。蛋白質(zhì)——shi——胨——多肽——肽——AA

1*1045*1032*1031000200～500100?結(jié)構(gòu)通式：(脯氨酸除外)

－aa（一）常見氨基酸（20種）的結(jié)構(gòu)及分類(兼性離子形式)（中性分子形式）?分類脂肪族aa（15）芳香族aa(3)雜環(huán)族aa(2)一氨基一羧基aa：Gly,Ala,Val,Leu,Ile含羥基aa：Ser,Thr含硫aa：Cys,Met含酰胺基aa：Asn,Gln一氨基二羧基aa(酸性aa)：Asp,Glu二氨基一羧基aa(堿性aa)：Lys,ArgPheTyrTrpHisPro++-根據(jù)R基化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性分類黑色：非極性R基氨基酸綠色：極性R基氨基酸—一氨基一羧基氨基酸脂肪族氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸）返回—羥基氨基酸：（絲氨酸、蘇氨酸）返回—含硫氨基酸：（半胱氨酸、甲硫氨酸）返回—含酰胺基氨基酸（天冬酰胺、谷氨酰胺）—一氨基二羧基氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）返回返回—二氨基一羧基氨基酸：（賴氨酸、精氨酸）返回芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）返回雜環(huán)族氨基酸（組氨酸、脯氨酸）因?yàn)槠涮厥獾沫h(huán)狀R基團(tuán)，脯氨酸（Proline）一般不出現(xiàn)在α-螺旋中，而經(jīng)常出現(xiàn)在α-螺旋的開始處。由常見AA經(jīng)修飾而來的不常見的蛋白質(zhì)AA

羥脯氨酸：亞氨基酸之一，一般蛋白不存在這種氨基酸。在動物膠和骨膠原中含有L-羥脯氨酸。在生物體內(nèi)羥脯氨酸是由脯氨酸合成的，但不是以游離狀態(tài)，而是在肽鏈中被羥基化。5-羥賴氨酸：與羥輔氨酸同在膠原中發(fā)現(xiàn)，是一種特異的氨基酸，在5位上帶有羥基。一般認(rèn)為其合成是和羥輔氨酸一樣，是賴氨酸在膠原前驅(qū)物質(zhì)肽中被氧化而產(chǎn)生的，但與羥輔氨酸比較，其含量很少。150多種多是蛋白質(zhì)中L型α-AA衍生物有一些是β-，γ-，δ-AA有些是D-型AA

其他的非蛋白質(zhì)AA鳥氨酸瓜氨酸鳥氨酸：是一種堿性氨基酸，在蛋白質(zhì)中不能找到。作為尿素循環(huán)的一部分與尿素生成相關(guān)，在生物體內(nèi)與精氨酸、谷氨酸、脯氨酸能相互轉(zhuǎn)變。在鳥類中它與2分子的苯甲酸或苯乙酸等結(jié)合成鳥尿酸的形式起解毒作用。（二）氨基酸的物理性質(zhì)都為白色晶體，不同氨基酸結(jié)晶形狀不同。熔點(diǎn)很高，一般在200℃以上。溶解度：大多數(shù)氨基酸都溶于水。Pro溶解度最大，其次為lys,Arg。胱氨酸和Tyr的溶解度較小。氨基酸由于具有不對稱碳原子，所以具有旋光性。20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。

氨基酸的光吸收特性Tyr

max=275nm

Phe

max=257nmTrpmax=280nm-

蛋白質(zhì)max=280nm

在近紫外區(qū)(220-300nm）酪氨酸、苯丙氨酸和

色氨酸有光吸收。?氨基酸在晶體和水中主要以兼性離子存在。（三）氨基酸的酸堿性質(zhì)氨基酸的兩性解離氨基酸是一類兩性電解質(zhì)，它既起酸（質(zhì)子供體）的作用，又起堿（質(zhì)子受體）的作用。中性氨基酸的解離（以Gly為例）陽離子（A+）兼性離子（A0）K1兼性離子（A0）陰離子（A–）K2注：K1和K2分別為-COOH和-+NH3的解離常數(shù)?Handerson-Hasselbalch公式利用此公式可判斷任一pH條件下氨基酸各種基團(tuán)的帶電狀態(tài)。pK1=2.19pKR=4.25pK2=9.67pK1=1.82pKR=6.0pK2=9.17His在pH7處有顯著的緩沖能力酸性氨基酸的解離（Glu為例）堿性氨基酸的解離（His為例）pK1=2.34pK2=9.60中性氨基酸的解離（Gly為例）pH=pIpH>pIpH<pI電場中靜電荷+

0

-不移動移向正極移向負(fù)極

氨基酸的等電點(diǎn)（isoelectricpoint,pI）?在一定pH范圍內(nèi)，pH離pI越遠(yuǎn)，氨基酸所帶靜電荷越大；利用各種aa的pI不同，可通過電泳法、離子交換層析法進(jìn)行分離。調(diào)節(jié)溶液pH值，使氨基酸處于兼性離子狀態(tài)，此時氨基酸所帶正負(fù)電荷數(shù)相等，即凈電荷為0，在電場中既不向陽極又不向陰極移動，這時溶液的pH值即為氨基酸的等電點(diǎn)。定義pK1pK2pKRpI側(cè)鏈不解離中性氨基酸2.0~3.09.0~10.05~6酸性氨基酸AspGlu2.092.199.829.673.864.252.973.22堿性氨基酸ArgLysHis2.172.181.829.048.959.1712.4810.536.0010.769.747.59pI為兼性離子兩側(cè)相應(yīng)解離基團(tuán)pK的算數(shù)平均值。各種氨基酸的等電點(diǎn)甘氨酸5.97丙氨酸6.02谷氨酰胺5.65纈氨酸5.97亮氨酸5.98精氨酸10.76異亮氨酸6.02絲氨酸5.68賴氨酸9.74蘇氨酸6.53天冬氨酸2.98

組氨酸7.59天冬酰胺5.41谷氨酸3.22半胱氨酸5.02甲硫氨酸5.75苯丙氨酸5.48酪氨酸5.66色氨酸5.89脯氨酸6.30與2，4-二硝基氟苯（DNFB或FDNB）的反應(yīng)弱堿中DNP-氨基酸（黃色）Sanger試劑此反應(yīng)是Sanger法鑒定多肽或蛋白質(zhì)N末端氨基酸的依據(jù)。(四)氨基酸的化學(xué)反應(yīng)1.-NH2參加的反應(yīng)與苯異硫氰酸酯（PITC）反應(yīng)此反應(yīng)是Edman法鑒定多肽或蛋白質(zhì)N末端氨基酸的依據(jù)，在aa序列分析方面占有重要地位。苯乙內(nèi)酰硫脲-氨基酸（PTH-aa）PTC-aa2.-羧基參加的反應(yīng)例：成鹽和成酯反應(yīng)氨基酸鈉鹽干燥HCL回流氨基酸乙酯鹽酸鹽aa羧基成鹽成酯后，-COOH被保護(hù)，而-NH2的反應(yīng)活性加強(qiáng)。3.-氨基、α-羧基共同參加的反應(yīng)紫色物質(zhì)注意：脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì)。水合茚三酮此反應(yīng)用于定性、定量鑒定氨基酸。茚三酮反應(yīng)成肽反應(yīng)肽鍵4.側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)氨基酸R基上的功能團(tuán)也能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。功能團(tuán)：

羥基（Ser,Thr）巰基(Cys)苯基（Tyr,Trp）酚基(Tyr)吲哚基（Trp）咪唑基(His)胍基（Arg）甲硫基(Met)非-NH2(Lys)非-COOH(Asp,Glu)巰基易被空氣或其它氧化劑氧化胱氨酸在穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象上發(fā)揮很大作用二硫鍵注意：二硫鍵可被氧化劑和還原劑打開2+6HCOOH2+R—S—S—R2R—SH磺基丙氨酸巰基乙醇二硫蘇糖醇（DTT）6HCOOOH過甲酸二、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)氨基末端（N末端）羧基末端（C末端）一級結(jié)構(gòu)定義：蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸排列順序和連接方式。氨基酸殘基1.肽的結(jié)構(gòu)通式例：胰島素的一級結(jié)構(gòu)[英]Sanger等，1953FrederickSanger3對二硫鍵A鏈：20aaB鏈：31aa0.36nm2.肽鍵C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)肽鍵一般為反式構(gòu)型肽平面3.肽的物理和化學(xué)性質(zhì)物理性質(zhì)酸堿性質(zhì)化學(xué)反應(yīng)茚三酮反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)主要取決于游離末端的-NH2和-COOH及R基上可解離基團(tuán)。短肽為晶體，熔點(diǎn)很高。在水溶液中以兼性離子形式存在。具旋光性。胰蛋白酶：R1=

Lys,ArgR2Pro麋蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：R1=

Phe,Trp,TyrR2Pro胃蛋白酶：R1,R2=Phe,Trp,Tyr,Leu等R1Pro嗜熱菌蛋白酶：R2=Leu,Ile,Phe,Trp,Val,Tyr,MetR2Pro,Gly肽鏈內(nèi)切酶4.肽鏈的斷裂——酶解法和化學(xué)裂解法酶解法肽鏈外切酶氨肽酶羧肽酶CNBr：羥胺(NH2OH)：斷裂Asn-Gly之間的肽鍵化學(xué)裂解法R1=

Met,生成肽酰高絲氨酸內(nèi)酯部分裂解Asn-Leu和Asn-Ala之間的肽鍵三、蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的作用力主要是較弱的相互作用，即非共價鍵或次級鍵。

包括：

氫鍵、范德華力、疏水相互作用、鹽鍵（離子鍵）二硫鍵在維持蛋白質(zhì)構(gòu)象中也發(fā)揮重要作用?？稍诙嚯闹麈湹聂驶鹾王０窔渲g、側(cè)鏈與側(cè)鏈、側(cè)鏈與介質(zhì)水之間等處形成。氫鍵（hydrogenbond）?包括三種較弱的作用力:定向效應(yīng)：極性分子(或基團(tuán))之間誘導(dǎo)效應(yīng)：極性和非極性分子(或基團(tuán))之間分散效應(yīng)：非極性分子(或基團(tuán))之間?范德華距離（接觸距離，contactdistance）

范德華引力只有在兩個非鍵合原子處于一定距離才能達(dá)到最大，這個距離稱為范德華距離。等于兩個原子的范德華半徑之和。范德華力很弱，但具有加合性。范德華力（vanderWaalsforce）疏水基團(tuán)或疏水側(cè)鏈出于避開水的需要而被迫接近，這種現(xiàn)象稱為疏水相互作用。定義:變性劑（尿素、非極性溶劑、去污劑等）可破壞疏水相互作用。疏水相互作用（hydrophobicinteraction）F=(Q1Q2)/(εR2)Q1，Q2:電荷電量ε：介質(zhì)的介電常數(shù)R:電荷質(zhì)點(diǎn)間的距離

定義:正、負(fù)電荷之間的一種靜電作用。生理pH條件下，酸性aa帶負(fù)電荷，堿性aa帶正電荷。在分子的疏水內(nèi)部，帶相反電荷的側(cè)鏈可形成鹽鍵。鹽鍵:又稱離子鍵（ionicinteractions）對蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用。二硫鍵(disulfidebridge)(二)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(seconarystructure)-螺旋（-helix）-折疊（-pleatedsheet）-轉(zhuǎn)角（-turn）-凸起(-bulge)無規(guī)卷曲（randomcoil）定義：指多肽鏈借助H鍵折疊盤繞成沿一維方向具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。常見類型：-螺旋（-helix）0.54nm0.15nm0.5nm-螺旋的結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：1）多肽主鏈沿中心軸盤繞成右手或左手螺旋；2）每圈螺旋含3.6個氨基酸殘基，螺距0.54nm，每個氨基酸殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100°，沿軸上升0.15nm；螺旋直徑0.5nm;3）-螺旋中氨基酸殘基的側(cè)鏈伸向外側(cè)；4）相鄰螺旋間形成氫鍵，氫鍵幾乎與螺旋的長軸平行，是由肽鍵上酰胺氫與其前面N端第四個殘基上羰基氧之間形成。[NH-CH-CO]3CNOH3.613-螺旋影響-螺旋形成的因素

R基的電荷性質(zhì)：同種電荷可產(chǎn)生靜電斥力。例：多聚Lys(pH7)。

R基的結(jié)構(gòu)：

例：Pro、Hyp可中斷-螺旋。

R基的大?。篟基大，空間位阻大。例:多聚Ile-折疊片（

-pleatedsheet）-折疊股1）肽鏈主鏈取鋸齒狀折疊構(gòu)象。2）兩條或多條多肽鏈之間側(cè)向聚集在一起，相鄰多肽鏈羰基氧和酰胺氫之間形成氫鍵，氫鍵與肽鏈的長軸幾乎成直角。3）側(cè)鏈R基交替分布于片層平面兩側(cè)。4）肽鏈的走向可以是平行的，也可以是反平行的。-折疊結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：平行反平行

-轉(zhuǎn)角（

-turn）AB

TheStructuresoftwokindsofβ-turns.含有4個氨基酸殘基。第一個殘基的羰基氧和第四個殘基的酰胺氫之間形成氫鍵。Gly和Pro常在-turn中出現(xiàn)。-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：-轉(zhuǎn)角可改變肽鏈走向。

-凸起（

-bugle）大多數(shù)作為反平行β折疊中的一種不規(guī)則情況?？烧J(rèn)為是β折疊股中額外插入一個殘基。無規(guī)卷曲（randomcoil）多具有明確、穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。常構(gòu)成酶的活性部位和蛋白質(zhì)的特異功能部位。鈣結(jié)合蛋白中的E-Fhand結(jié)構(gòu)（二）超二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)中，由若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元（如-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角）組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則、在空間上能辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體，以充當(dāng)三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)件，稱為超二級結(jié)構(gòu)。三種基本組合形式：、、

。定義

Rossman折疊

（-螺旋束）2-4股右手-螺旋相互纏繞形成左手超螺旋連接鏈折疊股-螺旋（三）結(jié)構(gòu)域（structuredomain）定義：對于較大的蛋白質(zhì)分子（或亞基），多肽鏈往往由兩個或兩個以上相對獨(dú)立的三維實(shí)體締合而成三級結(jié)構(gòu)，這種獨(dú)立的折疊單位稱為結(jié)構(gòu)域。單結(jié)構(gòu)域多結(jié)構(gòu)域一般含100-200個氨基酸殘基。例：肌紅蛋白（153aa）例：己糖激酶（約1000aa）2個結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域存在的優(yōu)越性：結(jié)構(gòu)角度：

一條長的多肽鏈先分別折疊成幾個相對獨(dú)立的區(qū)域，再締合成三級結(jié)構(gòu)，在動力學(xué)上更為合理。功能角度：

--通過結(jié)構(gòu)域有利于構(gòu)建具有特定三維結(jié)構(gòu)的活性中心；

--結(jié)構(gòu)域間易發(fā)生相對運(yùn)動，有利于活性中心結(jié)合底物施加應(yīng)力。Theconformationalchangeinducedinhexokinasebythebindingofasubstrate(D-glucose,showninred).己糖激酶兩個結(jié)構(gòu)域之間為一個裂縫（四）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)定義：指多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上借助各種次級鍵進(jìn)一步盤繞成具有特定肽鏈走向的緊密球狀構(gòu)象。含有多種二級結(jié)構(gòu)元件，具有明顯的折疊層次。緊密的球狀實(shí)體，但活性部位具松散區(qū)域，以利于構(gòu)象變化。疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親水側(cè)鏈暴露在分子表面。分子表面有一個空穴（裂縫、口袋、凹槽），是結(jié)合配體并行使生物學(xué)功能的部位。共同特征：一級結(jié)構(gòu)：Mr.16700，含153aa,由一條多肽鏈和一個血紅素輔基組成。

二級結(jié)構(gòu)：-螺旋：8段，命名為A,B,C…..H

松散肽段：位于螺旋之間和C末端三級結(jié)構(gòu)：8個螺旋段大體分成兩層，整個分子緊密結(jié)實(shí)，分子內(nèi)部僅能容納4個水分子。Mb是哺乳動物肌細(xì)胞貯存和分配氧的蛋白質(zhì)。例：肌紅蛋白(Mb)的三級結(jié)構(gòu)

血紅素（heme）結(jié)合的位置位于肌紅蛋白表面的疏水洞穴內(nèi)。疏水微環(huán)境可防止Fe（II）被氧化成Fe（III）從而失去載氧能力。血紅素（Fe-原卟啉IX）卟啉血紅素（鐵原卟啉IX）

由原卟啉IX與一個Fe原子（II或III）組成。Fe（II）有六個配位鍵，四個與卟啉N結(jié)合，第5個與F8His殘基的咪唑N結(jié)合，第6個呈開放狀態(tài)，是O2的結(jié)合部位，其附近為E7His。因E7His的存在而產(chǎn)生的空間位阻可降低血紅素對CO的親和力。（五）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)定義

具三級結(jié)構(gòu)的球狀蛋白質(zhì)以非共價鍵締合在一起，形成的聚集體稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。其中每個球狀蛋白質(zhì)稱為亞基。指蛋白質(zhì)與配基結(jié)合改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)生物活性的現(xiàn)象。寡聚蛋白質(zhì)與別構(gòu)效應(yīng)例：血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能（1）寡聚蛋白質(zhì):Mr.65000。具四個亞基（22），每個亞基與一個血紅素分子結(jié)合。（2）一級結(jié)構(gòu):

:141aa:146aa9個保守殘基：F8His(87,92)、E7His（58,63）等（3）二、三級結(jié)構(gòu)：和鏈與Mb相類似亞基間具8個鹽橋兩個亞基與1分子BPG

(2,3-二磷酸甘油酸)形成8個鹽橋（4）四級結(jié)構(gòu)：分子近球形，四個亞基占據(jù)四面體的四個角，以鹽鍵相連。由于這些鹽橋，血紅蛋白在未與氧結(jié)合之前，分子構(gòu)象受到很大束縛。Thethree-dimensional(quaternarylstructureofdeoxyhemoglobin.(a)Aribbonrepresentation.(b)Aspace-fillingmodel.Theαsubunitsareshowninwhiteandlightblue;theβsubunitsareshowninpinkandpurple.Notethatthehemegroups,showninred,arerelativelyfarapart.Saltbridgesbetweensubunitsinhemoglobin.四、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化技術(shù)1.蛋白質(zhì)的大小和分子量蛋白質(zhì)分子量:

6000—