課題 血紅蛋白的提取和分離

課題血紅蛋白的提取和分離第一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一思考1分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。思考2蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。第二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一一、基礎(chǔ)知識：㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：

1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩）

2、概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進行分離。第三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一分子量大小直徑大小大于凝膠顆粒空隙直徑，被阻擋在顆粒的外面小于凝膠顆粒空隙直徑，可以進入顆粒內(nèi)部運動方式垂直向下移動垂直向下移動，無規(guī)則擴散進入顆粒內(nèi)部運動速度較快較慢運動路徑較短較長洗脫次序先從凝膠柱洗脫出來后從凝膠柱洗脫出來3、原理第四頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，分子量大的蛋白質(zhì)A．路程較長，移動速度較慢B．路程較長，移動速度較快C．路程較短，移動速度較慢D．路程較短，移動速度較快D第五頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一4、具體過程第六頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進行過程可表示為圖中哪一個B第七頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液：2、作用：能夠抵制（）對溶液（）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿pH值第八頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一3、緩沖溶液的配制通常由（）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（）就可以制得（）使用的緩沖液。1－2使用比例在不同PH范圍內(nèi)思考：說出人體血液中緩沖液。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3磷酸緩沖液，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究其(活性)4、在本課題中使用的緩沖液？第九頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一（三）電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理：

①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負(fù)電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳第十頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動瓊脂糖凝膠電泳示意圖第十一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一

4、聚丙稀酰胺凝膠電泳（1）聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N，亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。為了消除凈電荷對遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。（2）原理：第十二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。（3）SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳作用機理:第十三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異第十四頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一

二、實驗操作：

樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定第十五頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一

蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白稀釋；離心等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。二、實驗操作：第十六頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一血液血漿水分其他物質(zhì)：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團1.血液有哪些成分？2.你認(rèn)為鳥類血液和哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？第十七頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一（一）樣品處理1、紅細(xì)胞的洗滌：2、血紅蛋白的釋放：3、分離血紅蛋白溶液：4、透析：如何除無機鹽離子和小分子有機物質(zhì)呢？血液＋檸檬酸鈉→低速短時離心→吸出上層血漿→紅細(xì)胞＋5倍體積生理鹽水→緩慢攪拌10min→低速短時離心→吸出上清液→反復(fù)洗滌直至上清液無黃色在蒸餾水和甲苯（？）作用下，紅細(xì)胞破裂釋放紅細(xì)胞破碎混合液→中速長時離心（2000c/min×10min）→濾紙過濾除去脂質(zhì)→分液漏斗分離出血紅蛋白，得到紅色透明液體。裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析二、實驗操作：第十八頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一分離血紅蛋白溶液有機溶劑無色透明的甲苯層脂類物質(zhì)白色脂溶性物質(zhì)沉淀層血紅蛋白溶液紅色透明液體紅細(xì)胞破碎物沉淀暗紅色沉淀物第十九頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一透析過程動畫演示第二十頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一練習(xí)鞏固1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代，對蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B弄清各種蛋白質(zhì)的功能C弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程D獲得高純度的蛋白質(zhì)第二十一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是A相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D二者根本無法比較第二十二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A調(diào)節(jié)pHB維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng)C防止微生物生長D防止血液凝固第二十三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的O2分子數(shù)和CO2分子數(shù)分別是A4、2B4、4C2、1D、1、16、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序自上而下是：有機溶劑-----脂類物質(zhì)-----血紅蛋白溶液------紅細(xì)胞破碎物沉淀第二十四頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一（二）凝膠色譜操作---純化1、凝膠色譜柱的制作：二、實驗操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定色譜柱的制作過程：準(zhǔn)備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱第二十五頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一ＡＣＤ凝膠色譜柱取長為40cm，內(nèi)徑為1．6cm，有關(guān)說法中，正確的是(多選)A．一般凝膠色譜柱直徑的大小不影響分離的效果B．凝膠色譜柱過高超過1m，不影響分離的效果C．凝膠色譜柱過矮，則影響混合物的分離度D．凝膠色譜柱直徑過大會耗用過多洗脫液，樣品的稀釋度過大第二十六頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一2、凝膠色譜柱的裝填步驟操作要求①操作要求色譜柱垂直固定在支架上②計算稱量凝膠根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量③配制懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹凝膠顆粒＋洗脫液→沸水?、苎b填懸浮液一次性緩慢倒入；輕輕敲打⑤緩沖液洗滌平衡立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h第二十七頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一裝配好的凝膠柱第二十八頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一3、樣品加入與洗脫---調(diào)節(jié)緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)（1）調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。（2）滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。（3）樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。（4）洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。（5）收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）（6）注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。第二十九頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一注意：正確的加樣操作是（1）不要觸及并破壞凝膠面。（2）貼壁加樣。（3）使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。3、樣品加入與洗脫---調(diào)節(jié)緩沖液面→加入蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)第三十頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一思考下面的問題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。

1、在血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？

2、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點？這一特點對你進行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？

血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？

血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。第三十一頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一收集得到的純化后的蛋白第三十二頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一在裝填凝膠柱時，不能有氣泡存在的原因是A、氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果B、氣泡阻礙蛋白質(zhì)的運動C、氣泡與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)D、氣泡在裝填凝膠的時候，使凝膠不緊密A第三十三頁，共三十五頁，編輯于2023年，星期一樣品的加入和洗脫的操作不正確的是A．加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢