轉(zhuǎn)基因與作物育種

轉(zhuǎn)基因與作物育種1第一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二作物轉(zhuǎn)基因育種就是根據(jù)育種目標(biāo)，從供體生物中分離目的基因，經(jīng)DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接運(yùn)載進(jìn)入受體作物，經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的遺傳工程體，并經(jīng)過田間試驗(yàn)與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源。轉(zhuǎn)基因作物（GMC，geneticallymodifiedcrops）什么是轉(zhuǎn)基因育種?2第二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為復(fù)雜，要求也很高，但是具有常規(guī)育種所不具備的優(yōu)勢：1.拓寬可利用的基因資源；2.培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗優(yōu)良品種提供了嶄新的育種途徑；3.可以對植物的目標(biāo)性狀進(jìn)行定向變異和定向選擇；4.可以大大提高選擇效率，加快育種進(jìn)程。此外，還可將植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物等生物制品。3第三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二TraditionalcrossbreedingRecombinantDNAtechniques4第四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二

一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀第一節(jié)作物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)自從1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來，至今已有120種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。1996年全球大面積種植，并不斷擴(kuò)大。國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)局（ISAAA）統(tǒng)計(jì)結(jié)果5第五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二世界銀行下屬機(jī)構(gòu)預(yù)測，世界范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)的交易額：2005年達(dá)到60億美元；2010年達(dá)到200億美元，1500萬農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物種植國家先后有30多個(gè)國家批準(zhǔn)了3000多例田間試驗(yàn)，涉及的植物種類有40多種；2000年有13個(gè)國家種植商品化轉(zhuǎn)基因植物；2004年有17個(gè)國家種植商品化轉(zhuǎn)基因植物。（2004年）美國（59%），阿根廷（20%），加拿大（6%）中國（5%），歐洲很少2004年3月英國批準(zhǔn)大面積種植轉(zhuǎn)基因，但要求非常嚴(yán)格。2005年德國通過法案，嚴(yán)格限制（包括實(shí)驗(yàn)室研究）。6第六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二美國：3900萬公頃加拿大：350萬公頃阿根廷：1350萬公頃中國：210萬公頃7第七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二轉(zhuǎn)基因作物種類主要為大豆、玉米、棉花和油菜等，以轉(zhuǎn)基因大豆面積最大。

目標(biāo)性狀抗除草劑：2000年使用抗除草劑大豆、玉米和棉花占轉(zhuǎn)基因作物74%。抗蟲和抗病毒?。?000年，Bt玉米、Bt棉花占19%。耐除草劑+抗蟲性雙價(jià)的轉(zhuǎn)基因棉花和玉米占7%。8第八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二美國三大轉(zhuǎn)基因作物歷年種植面積9第九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二Firstbiotechplantproduct–Flav’rSav’rtomato10第十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二我國轉(zhuǎn)基因作物研究與利用概況

我國是世界上第一個(gè)商品化種植轉(zhuǎn)基因作物的國家。自行培育的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草的抗病蟲性達(dá)到60％，產(chǎn)量比對照增加15％，產(chǎn)值增加20％，1992年每畝增收200元，遺憾的是由于市場的原因現(xiàn)已不推廣。

到1999年我國已批準(zhǔn)中試的轉(zhuǎn)基因作物有48項(xiàng)：包括水稻、小麥、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、煙草、廣藿香等11種作物；主要目標(biāo)性狀是抗蟲、抗病、耐鹽、抗凍、耐儲藏和抗衰老等。已批準(zhǔn)環(huán)境釋放的有49個(gè)品種，涉及水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄、甜椒、線辣椒、棉花、楊樹、煙草等10種作物。11第十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二經(jīng)全國基因工程安全委員會批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)的作物已有：我國自行研制開發(fā)的抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花（轉(zhuǎn)Bt及Bt+CpTI雙價(jià)抗蟲棉）；

2004年種植轉(zhuǎn)基因棉花370萬公頃，占棉花種植面積的50%

美國Monsanto公司開發(fā)的Bt抗蟲棉；延遲成熟期的轉(zhuǎn)基因番茄；抗黃瓜花葉病毒(CMV)轉(zhuǎn)基因番茄；抗CMV轉(zhuǎn)基因甜椒；轉(zhuǎn)查爾酮合酶（CHS）反義RNA基因矮牽牛。12第十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二由中國農(nóng)科院生物工程中心開發(fā)的Bt棉對棉鈴蟲有顯著的抗性。與對照相比減少農(nóng)藥用量80％，并減少用工150個(gè)/hm2，以上兩者可使每公頃節(jié)省1500元，Bt轉(zhuǎn)基因棉種深受棉農(nóng)的歡迎。13第十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二二、 轉(zhuǎn)基因育種的程序基因分離體外重組轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體安全性評價(jià)結(jié)合常規(guī)育種轉(zhuǎn)基因品種遺傳穩(wěn)定性評價(jià)市場開發(fā)載體的構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因槍轟擊篩選14第十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二(一)目的基因的獲得

根據(jù)獲得基因的途徑主要可以分為兩大類：根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物—蛋白進(jìn)行基因克?。粡幕蚪MDNA或mRNA序列克隆基因。1.根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物—蛋白進(jìn)行基因克隆

主要步驟如下：利用這種方法人類首次人工合成了胰島素基因。雖然在早期采用這種方式已經(jīng)成功地克隆了許多基因。局限性：兼并密碼子效率低未知基因及產(chǎn)物分離蛋白質(zhì)明確氨基酸序列推導(dǎo)核苷酸序列人工合成15第十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二2.從基因組DNA或mRNA序列克隆基因(1)同源序列法

(HomologyBasedCandidateGeneMethod)根據(jù)基因家族成員所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有保守氨基酸序列的特點(diǎn)克隆基因家族未知成員。氨基酸序列比較設(shè)計(jì)簡并引物PCR擴(kuò)增文庫篩選/RACE16第十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二(2)表達(dá)序列標(biāo)簽EST是指能夠特異性標(biāo)記某個(gè)基因的部分序列，通常包含了該基因足夠的結(jié)構(gòu)信息區(qū)，可以與其它基因相區(qū)分。主要是通過cDNA的途徑獲得。

獲得EST的途徑:

大規(guī)模cDNA文庫測序各種mRNA水平的分析手段mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄酶cDNA文庫PCR差異顯示抑制消減雜交…ESTRACE/文庫篩選dbESTGenBank17第十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二(3)根據(jù)連鎖圖譜克隆目的基因

圖位克隆技術(shù)(Map-basedcloning)18第十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二MarkercM10.8aGenecbpBAC染色體步移亞克隆cDNA文庫篩選互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)精細(xì)定位染色體步移候選基因19第十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二(4)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法轉(zhuǎn)座子是染色體上一段可復(fù)制、移動的DNA片段。當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到某個(gè)功能基因內(nèi)部時(shí)，就會引起該基因的失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型；當(dāng)轉(zhuǎn)座子再次轉(zhuǎn)座或切離這一位點(diǎn)時(shí)，失活基因的功能又可得到恢復(fù)。目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是Ac/Ds玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。插入突變體篩選突變DNA文庫，PCR，RACE鑒定性狀遺傳分析轉(zhuǎn)座子DNA探針基因部分DNA探針篩選野生型DNA文庫，PCR，RACE完整目的基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)20第二十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二(5)差異顯示法在生物個(gè)體發(fā)育不同階段，或不同的組織與細(xì)胞中或不同環(huán)境下，基因表達(dá)差異。即不同基因有序的時(shí)空表達(dá)方式，叫做基因的差異表達(dá)。差異顯示PCR(differentialdisplay-PCR,DD-PCR)是指通過對來源特定組織類型的總mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，并找出待測組織和對照之間的特異擴(kuò)增條帶。葉mRNA根mRNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR隨機(jī)引物+3’

錨定poly(t)引物PCRPAGE葉根21第二十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二(6)cDNA微陣列,cDNA芯片cDNA序列（純樣）機(jī)器點(diǎn)樣在支持物,與熒光標(biāo)記的不同mRNA樣品分別進(jìn)行雜交,通過激光共聚焦掃描分析不同cDNA序列的雜交信號強(qiáng)度,判斷該cDNA在不同mRNA樣品中的表達(dá)豐度.mRNA1mRNA222第二十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二(6)電子克隆insilicocloning

借助于電子計(jì)算機(jī)，利用公布的核酸序列資料，進(jìn)行序列的拼接和組裝最終獲得完整基因序列的技術(shù)，類似于cDNA文庫的篩選但更加方便和快速。23第二十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二（二）目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

目的基因體外重組到適當(dāng)?shù)囊迅脑斓馁|(zhì)粒中包括保存用中間載體（大腸桿菌寄主）：pBR322、pUC、

pBluescriptK、pKS,pGEM-T

繁殖載體（大腸桿菌寄主）：JM109,TOP10

植物轉(zhuǎn)化載體（農(nóng)桿菌寄主）：pBI121,pCAM100124第二十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二分離基因克隆到某中間載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒限制酶切/連接克隆到植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌基因槍轉(zhuǎn)化pKS,pBR332,pGEM-TJM109,TOP10…HindIII/EcroI…T4ligasepBI121,pCAM1001…LBA4404,EHA25第二十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二農(nóng)桿菌:usedextensivelyforgeneticengineeringofplants.包含Ti質(zhì)粒

Tumorinducingplasmid(bacterialplasmid)T-DNA(Transferred-DNA),

可以轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物基因組.TumorinducedbyA.tumefaciens26第二十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori已知農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。T-DNA首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。auxin27第二十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為95～156×106D,約有200kb組成。根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型(octopine)胭脂堿型(nopaline)農(nóng)桿堿型（agropine）農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine)Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型28第二十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域

（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：

農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。（2）Vir區(qū)（virulenceregion）

該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。（3）Con區(qū)（regionsencodingconjugations）

該區(qū)段上存在著與細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（originofreplication）

該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。29第二十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：①Ti質(zhì)粒分子量過大，一般在160～240kb，比pBR322質(zhì)粒大50倍左右；②大型的野生Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)，不能通過體外DNA重組技術(shù)直接向野生型Ti質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因；③T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，其中Onc基因的產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株的再生；④Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制,即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增；⑤Ti質(zhì)粒上還存在一些對于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。30第三十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二雙元載體系統(tǒng):binaryTivectorsystem31第三十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記

如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體同樣是一個(gè)重要問題?？茖W(xué)家家一直試圖把轉(zhuǎn)化體帶上一個(gè)標(biāo)記，從而便于選擇和篩選。至今己建立了許多標(biāo)記基因，并已插入各種轉(zhuǎn)化載體中，作為一種標(biāo)記基因。32第三十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二必須具備以下四個(gè)條件：①編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶；②基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；③能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)；④檢測容易，并且能定量分析。細(xì)菌篩選標(biāo)記基因：產(chǎn)物給予細(xì)胞產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長、發(fā)育與分化。而轉(zhuǎn)化細(xì)胞對該標(biāo)記產(chǎn)生抗性，不影響其生長等，從而將轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇出來，例如，Cat（氯霉抗性基因）。植物篩選標(biāo)記基因：強(qiáng)調(diào)給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶上一種標(biāo)記，起報(bào)告和識別作用，故稱報(bào)告基因。

33第三十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二報(bào)告基因:

Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因）在植物細(xì)胞中所產(chǎn)生的葡糖苷酸酶在檢測上具有以下特點(diǎn)：①在一定條件下與X-G1ucuionicacid（5-bromo-4-chioro-3-indoyl-β-D-glucuronicacid）底物發(fā)生作用，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，既可以用分光光度計(jì)法測定，又可以直接觀察到植物組織中形成的藍(lán)色斑點(diǎn)。②當(dāng)加入4-甲基傘形酮基和葡萄糖苷酸時(shí)生成4-甲基傘形酮，發(fā)熒光（λ=465nm）。因而可以用熒光光譜法測定。由于熒光強(qiáng)度高，本底低，故熒光檢測極為靈敏。③檢測容易、迅速并能定量，只需少量植物組織抽提液即可在短時(shí)間內(nèi)測定完畢。④價(jià)格便宜。34第三十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二35第三十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二GFP（綠色熒光蛋白基因）;

LUC(螢火蟲熒光素酶基因);報(bào)告基因:36第三十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二啟動子的選擇35S,cauliflowermosaicvirus35Spromoter

CaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues.

37第三十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二(三〕受體材料的選擇

受體是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件：1、高效穩(wěn)定的再生能力；2、受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；3、外植體來源方便，如胚和其它器官等；4、對篩選劑敏感；5、轉(zhuǎn)化率高38第三十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二常用的受體材料有以下幾大類型:1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點(diǎn)：外植體來源廣，繁殖快，易接受外源基因，轉(zhuǎn)化效率高。缺點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)39第三十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二2.直接分化再生系統(tǒng)

外植體材料細(xì)胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點(diǎn)：周期短、操作簡單，體細(xì)胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點(diǎn)：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體恢復(fù)細(xì)胞壁具有分化再生能力，是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點(diǎn)：高效、廣泛地?cái)z取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得基因型一致的克隆細(xì)胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點(diǎn)：不易制備、再生困難和變異程度高。40第四十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二4.胚狀體再生系統(tǒng)是指具有胚胎性質(zhì)的個(gè)體。優(yōu)點(diǎn)：個(gè)體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力強(qiáng)，嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點(diǎn)：技術(shù)含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。5.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞等受體細(xì)胞進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。41第四十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二（四）轉(zhuǎn)基因方法概括起來說主要有兩類：第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法。第二類是外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化。42第四十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二1.載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)最常見的轉(zhuǎn)基因方法。將外源基因重組進(jìn)入適合的載體系統(tǒng)，通過載體將攜帶的外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，整合在核染色體組中并隨核染色體復(fù)制和表達(dá)。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒（tumor-inducingplasmid）或Ri質(zhì)粒(root-indcing

plasmid)介導(dǎo)法是迄今為止植物基因工程中應(yīng)用最多、機(jī)理最清楚、最理想的載體轉(zhuǎn)移方法。43第四十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二農(nóng)桿菌共培養(yǎng)侵染誘導(dǎo)愈傷組織分化生芽生根葉盤轉(zhuǎn)化法(1)葉盤法

雙子葉植物較為常用、簡單有效的方法。44第四十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二

(2)真空滲入法將適宜轉(zhuǎn)化的健壯植株倒置浸于裝有攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌滲入培養(yǎng)基的容器中，經(jīng)真空處理，造傷，使農(nóng)桿菌通過傷口感染植株，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下，發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。簡便、快速、可靠，不需要組織培養(yǎng)。(3)愈傷組織共培養(yǎng)(4)原生質(zhì)體共培養(yǎng)45第四十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二2.外源基因直接導(dǎo)入法（1）化學(xué)刺激法細(xì)胞融合劑：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）46第四十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二(2)基因槍轟擊法

（微彈轟擊技術(shù)micro-projectilebombardment)將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，借助高壓動力射入受體細(xì)胞或組織，最后整合到植物基因組并得以表達(dá)。步驟簡單易行：適合于大多數(shù)細(xì)胞或組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。單子葉植物47第四十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二1.Pericarpsholudbepulledbackandtheimmatureembryos(0.5-1.0mm)areremoved.2.TheimmatureembryosareplacedonacallusinductionmediumhighosmoticmediapreparecallifortransfomationTransformationisperformedbygenegunmethod48第四十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二49第四十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二(4)微注射法

細(xì)胞操作：利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附等方式將受體細(xì)胞（原生質(zhì)體或生殖細(xì)胞）固定，然后將供體DNA或RNA直接注射進(jìn)入受體細(xì)胞。子房注射法或花粉管通道法：具有較大子房或胚囊的植株可在田間進(jìn)行活體操作。操作簡便、成本低。50第五十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二（五）轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定1.轉(zhuǎn)化體的篩選外源目的基因轉(zhuǎn)化頻率低目的基因已被整合到核基因組并表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞更少使用特異性選擇標(biāo)記基因（selectablemarkergenes）進(jìn)行標(biāo)記，有效地選擇出真正轉(zhuǎn)化細(xì)胞。常用選擇標(biāo)記基因：抗生素抗性基因除草劑抗性基因?qū)⑦x擇標(biāo)記基因與適當(dāng)啟動子構(gòu)成嵌合基因，克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。標(biāo)記基因在受體細(xì)胞表達(dá)，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有抵抗相應(yīng)抗生素或除草劑的能力而存活下來。非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則被抑制、殺死。51第五十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二2.轉(zhuǎn)化體的鑒定通過篩選得到的再生植株初步證明標(biāo)記基因整合進(jìn)入受體細(xì)胞。至于目的基因是否整合到受體核基因組、是否表達(dá)，還必須對抗性植株進(jìn)一步檢測。DNA水平的鑒定檢測內(nèi)容：是否整合、拷貝數(shù)、整合位置。檢測方法：特異性PCR（以外源基因兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物）

Southern雜交（外源目的基因序列為探針）52第五十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二特異性PCR檢測外源基因整合到受體53第五十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二(2)轉(zhuǎn)錄水平的鑒定常用的方法Northern雜交（標(biāo)記的RNA為探針對總RNA雜交）RT-PCR檢測mRNAcDNAPCR54第五十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二55第五十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二（3）翻譯水平的鑒定為檢測外源基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA能否翻譯，還必須進(jìn)行翻譯或者蛋白質(zhì)水平檢測。主要方法：Western雜交免疫檢測56第五十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二（六）轉(zhuǎn)化體的安全性評價(jià)和育種利用根據(jù)有關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理規(guī)定、在可控制的條件下進(jìn)行安全性評價(jià)和大田育種利用研究。通過轉(zhuǎn)基因方法往往難以直接獲得理想的品種（系）原因：外源基因失活、純合致死、花粉致死、其它性狀變化等。因此獲得轉(zhuǎn)化體后，應(yīng)結(jié)合雜交、回交、自交等常規(guī)轉(zhuǎn)育手段，最終選育綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因品種。57第五十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二第二節(jié)轉(zhuǎn)基因作物的遺傳特點(diǎn)少數(shù)外源基因整合到植株能穩(wěn)定遺傳，正常表達(dá)，符合孟德爾遺傳。大多失活或表現(xiàn)復(fù)雜的遺傳方式。原因：外源基因受宿主基因組排斥而發(fā)生片段丟失、重排；多拷貝；整合隨機(jī)性；一、整合機(jī)制1、同源重組2、位點(diǎn)特異性重組3、轉(zhuǎn)座4、異常重組58第五十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二二、整合后外源基因表現(xiàn)不表達(dá)1、基因丟失2、基因沉默表達(dá)1、符合孟德爾遺傳2、獨(dú)立轉(zhuǎn)化體之間差異3、無規(guī)律59第五十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二第三節(jié)轉(zhuǎn)基因作物品種的選育

純系育種回交育種雜交育種雜交種60第六十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二第四節(jié)轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性61第六十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二

直至今天，轉(zhuǎn)基因作物的安全性在全球范圍內(nèi)引起了激烈的爭論。反對者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物具有極大的潛在危險(xiǎn)，可能會對人類健康和人類生存環(huán)境造成威脅。在歐洲，轉(zhuǎn)基因作物被一些媒體稱之為“惡魔食品”（frankensteinfood）。Frankenstein是英國科幻小說中由一個(gè)科學(xué)家創(chuàng)造、最終又毀滅了這個(gè)科學(xué)家的怪物。那么，人類研制與種植轉(zhuǎn)基因作物到底是毀滅自己，還是拯救自己呢？

62第六十二頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二對轉(zhuǎn)基因作物的安全性爭論，國際上有幾個(gè)典型的事件。

Pusztai事件：英國Rowett研究所有位Pusztai博士，他用轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英國電視臺發(fā)表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官重量減輕，免疫系統(tǒng)受到了破壞。后果：綠色和平組織、地球之友等反生物技術(shù)組織把這種土豆說成“殺手”，并策劃了破壞轉(zhuǎn)基因作物試驗(yàn)地等行動，焚燒了印度的兩塊試驗(yàn)田，甚至美國加州大學(xué)戴維斯分校的非轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)材料也遭破壞，以致研究生畢業(yè)論文都無法如期完成。英國皇家學(xué)會組織了同行評審，并于1999年５月發(fā)表評論，指出Pusztai的試驗(yàn)有六方面的錯(cuò)誤：不能確定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的化學(xué)成分有差異；對食用轉(zhuǎn)基因土豆的大鼠，未補(bǔ)充蛋白質(zhì)以防止饑餓；供試動物數(shù)量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的標(biāo)準(zhǔn)食物，缺少統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；試驗(yàn)設(shè)計(jì)差；統(tǒng)計(jì)方法不當(dāng)；試驗(yàn)結(jié)果無一致性等。63第六十三頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二

斑蝶事件：

1999年5月，康奈爾大學(xué)的一個(gè)研究組在《Nature》雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國大斑蝶，導(dǎo)致44％的幼蟲死亡。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果在科學(xué)上沒有說服力：玉米的花粉非常重，擴(kuò)散不遠(yuǎn)，在玉米地以外５米，馬利筋葉片/CM2上只找到一個(gè)玉米花粉；2000年開始在美國三個(gè)州和加拿大進(jìn)行的田間試驗(yàn)都證明，抗蟲玉米花粉對斑蝶并不構(gòu)成威脅，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中用１０倍于田間的花粉量來喂大斑蝶的幼蟲，也沒有發(fā)現(xiàn)對其生長發(fā)育有影響。斑蝶減少的真正原因，一是農(nóng)藥的過度使用，二是墨西哥生態(tài)環(huán)境的破壞。64第六十四頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二

加拿大“超級雜草”事件：由于基因漂流，在加拿大油菜地里發(fā)現(xiàn)了個(gè)別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級雜草”，并怪罪于轉(zhuǎn)基因?；蚱鞑⒉皇菑霓D(zhuǎn)基因作物開始。如果沒有基因漂流，就不會有進(jìn)化，世界上也就不會有這么多種的植物和現(xiàn)在的作物栽培品種。舉例來說，小麥由Ａ、Ｂ、Ｄ三個(gè)基因組組成，它是由分別帶有Ａ、Ｂ、Ｄ基因組的野生種經(jīng)過基因漂流合成的。所以，以此來禁止轉(zhuǎn)基因作物，也是沒有道理的。65第六十五頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二中國Ｂt抗蟲棉破壞環(huán)境事件：

2002年6月3日，南京環(huán)科所與綠色和平組織在北京召開會議，６月４日《Chinadaily》上發(fā)表了題為“GMCottonDamageEnviroment”的文章。當(dāng)天,綠色和平組織在其網(wǎng)站上刊登了南京環(huán)科所、綠色和平組織顧問薛達(dá)元先生長達(dá)26頁的英文報(bào)告，從而再次引發(fā)國際爭論，在歐、美產(chǎn)生巨大反響。６月５日德國《農(nóng)業(yè)報(bào)》發(fā)表了題為“中國研究：Ｂｔ棉破壞環(huán)境巨大”。綠色和平組織的“中國項(xiàng)目主管”聲稱：“棉農(nóng)將面對不受控制的超級害蟲”、“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉不但沒有解決問題，反而制造了更多的問題”、“棉農(nóng)將被迫使用更多、更毒的農(nóng)藥”。事實(shí)上，抗蟲棉在中國實(shí)踐多年，深受廣大棉農(nóng)的歡迎。中國、美國、德國、加拿大、比利時(shí)、印度等國的科學(xué)家已在網(wǎng)上紛紛發(fā)表評論，反駁綠色和平組織的觀點(diǎn)。66第六十六頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二爭論的實(shí)質(zhì)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因作物的安全性已經(jīng)成了國際貿(mào)易的技術(shù)壁壘。由于某些媒體的炒作，對消費(fèi)者的心理和轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)業(yè)化已經(jīng)產(chǎn)生了很大的負(fù)面影響。我們的判斷？67第六十七頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二我們所要了解的轉(zhuǎn)基因植物的潛在風(fēng)險(xiǎn):1.轉(zhuǎn)基因植物釋放引發(fā)“超級雜草”目前轉(zhuǎn)入植物的基因以抗除草劑的為多，其次以抗蟲和抗病毒，然后是抗逆。如果這些基因逐漸在野生種群中定居后，就具有選擇優(yōu)勢的潛在可能，成為難以控制的“超級雜草”。68第六十八頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二2.轉(zhuǎn)基因植物中35S啟動子的生物安全性啟動子是基因表達(dá)所必需的，決定了外源基因表達(dá)空間、表達(dá)時(shí)間和表達(dá)強(qiáng)度等，是人們定向改造生物的重要限制因素。最常用的啟動子是35S啟動子，該啟動子能夠在植物組織中高水平表達(dá)。因此已經(jīng)被引入許多轉(zhuǎn)基因植物中。潛在風(fēng)險(xiǎn)問題:35S啟動子內(nèi)有一重組熱點(diǎn)。（1）如果35S啟動子插入到隱性病毒基因組旁，可能會重新活化病毒。（2）啟動子插入到某一編碼毒素蛋白的基因上游，可能會增強(qiáng)該毒素的合成。（3）當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物被動物或人類食用后，35S啟動子可能會插入到某一致癌基因上游，活化并且導(dǎo)致癌變。69第六十九頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二3.抗生素抗性標(biāo)記基因的生物安全性抗生素抗性標(biāo)記基因是否導(dǎo)致的在環(huán)境中的傳播。目前，轉(zhuǎn)基因作物都使用細(xì)菌編碼的抗生素抗性基因作為選擇性標(biāo)記。在過去的幾年里，越來越多的報(bào)道指出:細(xì)菌可以獲得對多種抗生素的抗性。這導(dǎo)致人們開始懷疑：轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因是否會轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中。抗性標(biāo)記基因是否會通過食物在腸道中水平轉(zhuǎn)移至體內(nèi)微生物，從而影響抗生素治療的有效性?？剐詷?biāo)記基因產(chǎn)物是否使人體產(chǎn)生抗藥性（食品安全性）。70第七十頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二4.轉(zhuǎn)基因食品的安全性1994年美國Caigene公司的轉(zhuǎn)基因延熟番茄經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市，成為第一例通過安全評價(jià)的轉(zhuǎn)基因植物食品。轉(zhuǎn)基因食品對人類的可能危害主要有3大類：（1）可能含有已知或未知的毒素，對人體產(chǎn)生毒害作用。（2）可能含有已知或未知的過敏源，引起人體的過敏反應(yīng)。（3）食品某些營養(yǎng)成分或營養(yǎng)質(zhì)量可能產(chǎn)生變化，使人體出現(xiàn)某種病癥。71第七十一頁，共七十七頁，編輯于2023年，星期二國外對轉(zhuǎn)基因食品管理的現(xiàn)狀

1.國際組織實(shí)質(zhì)等同原則表型性狀的等同成分等同

2000年《卡塔