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文檔簡(jiǎn)介
生物種類人擬南芥果蠅水稻蠕蟲流感病毒基因數(shù)目(萬個(gè))3~42.551.3651.780.175單個(gè)gene在整個(gè)基因組中所占的比例極其微小,加上復(fù)雜的基因間序列;對(duì)單個(gè)目的gene的分離如同大海撈針。當(dāng)前第1頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)已知基因的獲取方法:⒈PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因⒉化學(xué)方法人工合成目的基因當(dāng)前第2頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)未知基因的獲得途徑:⒈構(gòu)建基因組文庫(kù)利用鳥槍法克隆目的基因2.構(gòu)建cDNA文庫(kù),篩選目的基因3.mRNA差異顯示技術(shù)篩選差異表達(dá)基因4.酵母雙雜交體內(nèi)鑒定基因當(dāng)前第3頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)本章內(nèi)容第一節(jié)基因組DNA的片斷化
第二節(jié)基因的化學(xué)合成第三節(jié)目的基因的保存和擴(kuò)增第四節(jié)目的基因的分離和擴(kuò)增
當(dāng)前第4頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)第一節(jié)基因組DNA的片斷化二、限制性內(nèi)切酶消化法一、
機(jī)械切割法當(dāng)前第5頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)一.機(jī)械切割法(1)超聲波斷裂成約300bp的隨機(jī)片斷(2)高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min,可產(chǎn)生約8kb的隨機(jī)片斷(3)移液器抽吸法當(dāng)前第6頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)二、限制性內(nèi)切酶消化法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切基因組DNA當(dāng)前第7頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)1.優(yōu)點(diǎn)
如果帶有粘性末端,產(chǎn)物可以直接與載體連接,連接效率高當(dāng)前第8頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)2.缺點(diǎn)①目的基因內(nèi)部可能有內(nèi)切酶的切點(diǎn)BamHIBamHIBamHIGene目的基因也被切成碎片!當(dāng)前第9頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)②消化的片斷分子量太大或太小不符合載體容量,不能克隆解決的辦法采用隨機(jī)片斷化制備DNA的克隆片斷當(dāng)前第10頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)3.限制性內(nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時(shí)間,使基因組中的酶切位點(diǎn)只有一部分被隨機(jī)切開。①內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長(zhǎng)度和隨機(jī)程度限制性內(nèi)切酶的選用原則當(dāng)前第11頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)1)4bp的內(nèi)切酶平均每4096(46)bp一個(gè)切點(diǎn)。2)6bp的內(nèi)切酶平均每256(44)bp一個(gè)切點(diǎn)隨機(jī)程度高。如HaeⅢ、AluI、MobI、Sau3AI②內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點(diǎn)相連Sau3AIBamHI5’-GATC-3’5’-GGATC-3’當(dāng)前第12頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)文庫(kù):是指一種全體的集合。通過克隆方法保存在適當(dāng)宿主中的某種生物、組織、器官或細(xì)胞類型的所有DNA片段而構(gòu)成的克隆集合體。
克隆并不是為了保存,而是為了分離。
第三節(jié)目的基因的保存和擴(kuò)增一、基因文庫(kù)(genelibrary)1.基因文庫(kù)當(dāng)前第13頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)為什么要建基因文庫(kù)?高等生物的基因組DNA十分復(fù)雜,單個(gè)基因在基因組或某個(gè)特定發(fā)育階段或特定組織中所占比例很小。因此,要想從龐大的基因組中分離某個(gè)特定的未知基因非常難的,必須構(gòu)建基因文庫(kù),利用文庫(kù)篩選技術(shù)獲得該基因的陽(yáng)性克隆,然后對(duì)其進(jìn)行分析。當(dāng)前第14頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)基因文庫(kù)的分類基因組文庫(kù):提取染色體基因組DNA。如果要研究的是控制基因表達(dá)的調(diào)控序列,或是在mRNA中不存在的某種特定序列。cDNA文庫(kù):mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。如果研究的目標(biāo)是弄清一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列,可以根據(jù)克隆的cDNA分子的核苷酸序列推導(dǎo)出來。當(dāng)前第15頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)mRNA結(jié)構(gòu)圖DNA結(jié)構(gòu)圖當(dāng)前第16頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)2.基因文庫(kù)的構(gòu)建載體的制備DNA的提取及片段化、cDNA的合成載體與插入片段的連接
重組DNA分子導(dǎo)入宿主菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選當(dāng)前第17頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷,并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接,引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中繁殖保存和擴(kuò)增。二、基因組文庫(kù)的構(gòu)建1.基因組文庫(kù)理論上講,這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因當(dāng)前第18頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)篩選目的基因當(dāng)前第19頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)目前常用的載體2.載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫(kù)所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大,所要求的DNA片斷數(shù)目越少對(duì)載體的要求載體系列:容量為24kpcosmid載體:容量為50kbYAC:容量為1MbBAC:容量為300kb當(dāng)前第20頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)(1)λ噬菌體載體最常用
插入型載體構(gòu)建文庫(kù)時(shí),通常用限制性核酸內(nèi)切酶切割位于λ噬菌體DNA非必需區(qū)的單一酶切位點(diǎn),以供外源基因片段的插入,插入片段適宜長(zhǎng)度約為9kb。
替代型載體構(gòu)建文庫(kù)時(shí),需要將非必需區(qū)兩邊的臂進(jìn)行分析純化,才能用于連接,插入片段適宜長(zhǎng)度約為9~22kb。當(dāng)前第21頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第22頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)(2)黏粒載體不僅能克隆和增殖完整的真核基因,還可克隆和分析組成某一基因家族或基因座的真核DNA片段。構(gòu)建過程與噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建過程相似。(3)YAC、BAC載體克隆大片斷DNA的載體。可用來克隆完整的動(dòng)物基因。在人類基因組計(jì)劃中,YAC被廣泛地用于大規(guī)?;蚪M結(jié)構(gòu)分析。當(dāng)前第23頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)最早用于基因克隆的載體。只能容納比質(zhì)粒分子量更小的片段。不能用于核基因組文庫(kù)。適合于短序列的克隆文庫(kù)。葉綠體DNA文庫(kù)、線粒體DNA文庫(kù)、cDNA文庫(kù)。(4)質(zhì)粒載體當(dāng)前第24頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)3.基因組文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟(1)基因組DNA的提取關(guān)鍵:制備高分子質(zhì)量的基因組DNA經(jīng)典的方法:在EDTA和SDS存在下,用蛋白酶K消化細(xì)胞,然后用酚-氯仿混合液抽提蛋白質(zhì),并用透析法去除分子質(zhì)量雜質(zhì)。在提取時(shí)必須盡可能地避免機(jī)械切割當(dāng)前第25頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)關(guān)鍵:斷點(diǎn)完全隨機(jī),片斷長(zhǎng)度合適于載體連接(2)DNA克隆片段的制備超聲波(300bp)或機(jī)械攪拌(8kb)①物理切割法:內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化??傻玫?0-30kb的隨機(jī)片斷②酶切法:當(dāng)前第26頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第27頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)(3)載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。如:Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾②人工接頭法人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷當(dāng)前第28頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)各種酶的接頭可以向公司定做或購(gòu)買接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾當(dāng)前第29頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第30頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)4.基因組文庫(kù)的大小一個(gè)文庫(kù)要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫(kù)包含了整個(gè)基因組DNA的概率(99%)f:插入載體的DNA片斷的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因組DNA的百分?jǐn)?shù)N:所需的重組載體數(shù)(克隆數(shù))基因文庫(kù)的大小以及從中獲得特定序列的概率的計(jì)算公式:當(dāng)前第31頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)例如:人的基因組是3×109bp,插入DNA片斷的平均長(zhǎng)度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG:Genome大??;f:fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105當(dāng)前第32頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第33頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)5.基因組文庫(kù)的擴(kuò)增及保存(1)基因組文庫(kù)的擴(kuò)增①液體培養(yǎng)增殖法最簡(jiǎn)便混合培養(yǎng)方法:從瓊脂糖平板上挑取已長(zhǎng)出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中,混合的細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)代后,其培養(yǎng)物于-80℃儲(chǔ)存(加終濃度為25%的甘油)缺點(diǎn):由于細(xì)菌在液體中以混合群體的形式生長(zhǎng)和不同克隆生長(zhǎng)速率的差異,導(dǎo)致文庫(kù)中某些特定的序列過多或過少。當(dāng)前第34頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法:從平板上挑選單個(gè)克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中,菌體生長(zhǎng)到一定濃度后,加入終濃度為25%的甘油,于-80℃保存。缺點(diǎn):需保存的克隆子數(shù)過多,工作量大。當(dāng)前第35頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)384孔板當(dāng)前第36頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)②影印濾膜培養(yǎng)法失真最小,最麻煩用包裝后的噬菌體顆粒感染細(xì)菌,并讓細(xì)菌在硝酸纖維素膜上生長(zhǎng),然后將濾膜上的文庫(kù)影印到其他濾膜上,以供篩選和低溫(-80℃)保存。③制備已包裝的轉(zhuǎn)導(dǎo)性裂解物適用于粘粒文庫(kù),轉(zhuǎn)導(dǎo)性裂解物可以在低溫下長(zhǎng)期保存。當(dāng)前第37頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)(2)基因組文庫(kù)的保存小包裝,方便,避免反復(fù)凍融噬菌體一類的基因文庫(kù):密封,加入少許氯仿,在4℃冰箱內(nèi)可較長(zhǎng)時(shí)間地保存(6個(gè)月),低溫冰箱可保存數(shù)年。當(dāng)前第38頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)500kb50-300kb當(dāng)前第39頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)100-300kb,濃縮產(chǎn)物濃度達(dá)到100ng/ul當(dāng)前第40頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第41頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第42頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第43頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第44頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第45頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)三、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA文庫(kù):是指某種生物體某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。cDNA文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性,具有時(shí)效性。為什么要構(gòu)建cDNA文庫(kù)?真核生物的基因組DNA龐大且含有大量的重復(fù)序列,難以分離到目的基因片段。當(dāng)前第46頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)1.cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物2.cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)(1)不含內(nèi)含子序列(2)可以在細(xì)菌中直接表達(dá)(3)包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因(時(shí)效性)(4)比基因組DNA文庫(kù)小得多,容易構(gòu)建當(dāng)前第47頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)3.構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟當(dāng)前第48頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第49頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)(1)mRNA的來源特點(diǎn):多數(shù)基因的表達(dá)具有不同程度的組織特異性和發(fā)育階段性。
選用mRNA含量高的組織材料,或通過藥物等方法提高mRNA的含量。高豐度:當(dāng)特定的mRNA在細(xì)胞總mRNA群體中所占比例達(dá)到50~90%時(shí)。低豐度:當(dāng)上述比例小于0.5%時(shí)。當(dāng)前第50頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。利用真核生物mRNA都含有一段30~300個(gè)A組成的polyA尾巴,將mRNA從總RNA(rRNA、tRNA等)中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-5%。(2)mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化纖維素柱層析法當(dāng)前第51頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第52頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)③mRNA的長(zhǎng)度哺乳動(dòng)物mRNA長(zhǎng)度為500-8000bp,大部分mRNA位于。當(dāng)前第53頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄酶(3)cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。a.OligodT引導(dǎo)合成法從3’-開始,無法到達(dá)5’-末端mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物RNA-DNA雜交分子當(dāng)前第54頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)mRNA當(dāng)前第55頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)b.隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法合成6~10個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核苷酸短片段,作為合成第一鏈cDNA的引物。隨機(jī)引物可用于合成特長(zhǎng)的mRNA分子5’mRNA3’當(dāng)前第56頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’3’5’5’引物cDNA第一鏈3’5’引物②降解mRNA模板RNaseH當(dāng)前第57頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個(gè)彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)(機(jī)理不明),可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’③cDNA第二鏈合成自我引導(dǎo)合成法當(dāng)前第58頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)④去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)(這會(huì)導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉!)。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’當(dāng)前第59頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第60頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)這種酶能識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA,并將其降解成許多小片斷。妙用RNaseH(置換合成法)小片斷正好成為DNA聚合酶的引物,用來合成岡崎片斷。優(yōu)點(diǎn):a)合成cDNA的效率高
b)直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物,不需純化
c)避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA當(dāng)前第61頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)mRNAcDNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligase去引物當(dāng)前第62頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第63頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)在雙鏈cDNA末端接上人工接頭,即可與載體連接,轉(zhuǎn)入受體菌?;蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個(gè)C或G,成為粘性末端。(4)cDNA與載體連接:接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶當(dāng)前第64頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)當(dāng)前第65頁(yè)\共有74頁(yè)\編于星期五\22點(diǎn)4.cDNA文庫(kù)的大小一個(gè)cDNA文庫(kù)要包含99%的mRNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。:某一種低豐度(不足14份拷貝)mRNA占細(xì)胞整個(gè)mRNA的比例N=ln(1-p)ln(1-)1nP:
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